二氢查耳酮是黄酮类化合物中的一类，含有如图1所示的基本骨架。天然二氢查耳酮主要以糖苷形式存在于蔷薇科、壳斗科植物中，如多穗柯叶中的三叶苷、根皮苷和3-羟基根皮苷。研究表明，大多数二氢查耳酮糖苷没有毒性，水溶性和稳定性比非糖苷类的二氢查耳酮高。糖基类型、数目和连接位点的不同使二氢查耳酮类化合物的结构具有多样性，从而具有广泛的生物活性。
电子舌是近年发展起来的一种智能味觉分析技术，其客观性和可比性优于感官评价法。目前已广泛应用于食品的味道评价。日本Insent公司开发的甜味传感器是基于表面的人工双层脂质膜和呈味物质之间产生氢键作用、静电作用和疏水作用引起膜电位的变化被分析器捕获，对食品和饮料的甜味强度进行量化。广东工业大学轻工化工学院黄宝华教授课题组前期工作证实，该甜味传感器对二氢查耳酮化合物甜味评价具有一定的可靠性。本实验利用感官评价和电子舌检测相结合对相关化合物甜味进行评价和比较。
1、二氢查耳酮衍生物的合成
合成方法如图2所示。
为探讨二氢查耳酮A环和B环上的取代基对该类化合物甜味的影响，以天然柚皮苷为起始原料，制备了B环引入甲基、甲氧基、羟基、卤原子的13种衍生物（4a～4m）。在Claisen-Schmidt缩合和O-Michael加成步骤中，由于根皮乙酰苯-4’-β-新橙皮苷在A环上原有的糖基即可作为保护基团，避免A环受到羰基的电子效应影响转化成醌式结构、羰基转化成烯醇式结构而不能发生缩合反应，从而顺利发生缩合和加成获得3a～3m。然后，在弱碱条件下3a～3m经Pd/C催化加氢还原得到4a～4m，此时碱用量以5% NaOH为适宜，过高则生成极性较大的物质，未能检测出目标产物。
2、细胞毒性评价
为研究目标化合物的毒性，采用MTT法考察不同浓度的目标化合物（4a～4m）对HK2细胞存活率的影响，结果如图3所示。当化合物4a～4m浓度不高于400 μmol/L时，细胞存活率均大于80%。结果表明，4a～4m对HK2细胞均不具有明显的毒性。
3、感官评价和电子舌评价
以感官评价法预确定了对照品和4a～4m相应于“无甜味”、“弱甜味”、“较强甜味”3 个甜味描述词的浓度值，结果如表2所示。选取所得到的浓度值，以电子舌测定6种对照品和4a～4m的甜味值，结果如图4、5所示。
由图4可知，在表2中“弱甜味”的浓度下，HDC-7-G在0.04 mmol/L时电子舌甜味值为2.96，三叶苷0.60 mmol/L时甜味值为4.00，蔗糖29.50 mmol/L时甜味值为3.02，均高于呈苦味的根皮苷甜味值（0.2～1.0 mmol/L为1.13～2.15）。以上3种甜味对照品在电子舌甜味值小于3时人不能口尝出相应溶液的甜味，说明电子舌GL1的响应合理，与感官评价结果一致。单糖苷的三叶苷和HDC-7-G（均带有4-葡萄糖基）的甜味值低于其相应甜味更强的双糖苷NarDC和NHDC（均带有4-新橙皮糖基）（图4a、c）；根皮苷是带有6-葡萄糖基的单糖苷，其B环与三叶苷、NarDC相同，但甜味值更低。可见，B环相同时，GL1可区分二氢查耳酮糖苷A环上的糖基是在4位还是6位，连接的是葡萄糖基还是新橙皮糖基。
从图5可知，在相应表2“弱甜味”的浓度时，呈甜味的4a、4b、4h、4j～4m电子舌甜味值为5.92～15.01；“无甜味”的4d～4g、4i和呈苦味的4c甜味值为1.57～5.56；5种甜味对照品甜味值为2.92～8.16（图4a～c）。可见，GL1对此类呈甜味衍生物的响应值基本在合理范围内。实验过程中发现，使用同一根GL1测不同化合物的溶液会造成响应值重复性欠佳。
4、甜味构效关系
A环糖基的影响
由表2可知，A环上带4-新橙皮糖基或4-葡萄糖基的二氢查耳酮糖苷，有呈甜味的NarDC、NHDC、三叶苷、HDC-7-G、4h、4j、4k，亦有呈苦味的4c和无味的4i、4d、4e。可见二氢查耳酮糖苷呈味与A环的4-糖基并没有明确关系，尚取决于B环的取代情况。NarDC、三叶苷和NHDC、HDC-7-G的B环结构两两相同，NarDC、三叶苷的B环有4’-OH取代，NHDC、HDC-7-G同时有3’-OH和4’-OCH3取代。由表2可以看出，A环有4-新橙皮糖基的NarDC和NHDC的甜味皆比相应B环相同、A环带有4-葡萄糖基的三叶苷和HDC-7-G强得多。换言之，对于B环相同、A环4位有糖基取代的二氢查耳酮糖苷，新橙皮糖苷比单葡萄糖苷甜得多。三叶苷和根皮苷的B环相同，均为4’-OH取代，但是A环上葡萄糖基的取代位置不同。由表2可知，有4-葡萄糖基的三叶苷呈甜味，而连有6-葡萄糖基的根皮苷却呈苦味，表明二氢查耳酮糖苷的呈味与A环糖基取代的位置有关。
B环的影响
由表2可知，4a、4b、4h、4j～4m呈不同程度的甜味，4d～4g、4i没有甜味，4c呈苦味，可见B环上基团的差异会影响二氢查耳酮糖苷的呈味。其中，4g（3’-OCH3，4’-OH）与NHDC（3’-OH，4’-OCH3）的分子结构区别仅在于B环上3’位和4’位基团的互换，前者没有甜味，而后者具有强烈的甜味。呈甜味的4h（3’-OH）与NHDC结构差异在于后者多了4’-OCH3，表明4’-OCH3具有强烈增甜作用。4h和NarDC（4’-OH）均有“较强甜味”，两者差异在于B环—OH的位点不同。无甜味的4g（3’-OCH3、4’-OH）与NarDC（4’-OH）差异在于前者多了3’-OCH3，表明是4’-OH相邻的3’-OCH3有去甜作用。而4b（3’,5’-CH3、4’-OH）甜味明显低于NarDC（4’-OH），显然是前者在4’-OH旁边的两个—CH3使甜味大大减弱。可见4’-OH相邻的—CH3有降甜作用（4b）。4c（4’-CH3）呈苦味，与有甜味的4a（2’～6’位均无取代）比较，可说明4’-CH3具致苦作用；仅有—OCH3一种取代基但个数不同的4d（4’-OCH3）、4e（3’,4’-OCH3）、4f（3’,4’,5’-OCH3）均不呈甜味，与4a比较可说明B环3’,4’,5’位上仅有同一种取代基时—OCH3有去甜作用。4i（2’-OH）无甜味，卤原子取代的4j（4’-Cl）、4l（3’-Cl）、4k（4’-F）、4m（3’-F）呈“较强甜味”。与4a相比可知，B环2’位的OH对甜味没贡献。以上均说明B环3’位和4’位的取代基对二氢查耳酮的呈味至关重要。当B环2’～6’位无取代，或3’位、4’位仅连有OH、F、Cl之一，此7种化合物均可呈甜味。
结构-甜味效应机理探讨
Tinti等的多点结合甜味理论认为，人体甜味蛋白受体至少包含8 个基本识别部位，与甜味分子的结合部位相互作用产生甜味刺激。甜味分子与受体蛋白相互作用结合部位的数量和结合的有效程度决定了该甜味分子的甜度强弱，而结合的有效程度与甜味分子大小、立体空间构型、活性基团的化学性质有很大关系。对物质甜味感知的差异取决于甜味受体的结构变化，Winnig等通过对大鼠和人的两个与甜味有关的G蛋白偶联受体Tas1R2（taste receptor type 1 member 2）和Tas1R3（taste receptor type 1 member 3）的种间组合和嵌合体的分析，认为人Tas1R3的七肽结构域似乎与NHDC甜味受体的激活密切相关，并鉴定了一组不同的氨基酸残基，从而形成NHDC结合口袋。AH-B受体结合理论认为，所有甜味化合物都含有一个氢键供体（AH）和一个氢键受体（B），分别与受体上互补的受体（B）、供体（AH）相互作用，形成两个氢键和/或阻断受体蛋白上的分子内氢键而引发了甜味的感知。
结 论
合成了4a～4m共13 个二氢查耳酮衍生物，其中4a～4c、4j、4k、4e、4f、4l、4m为新化合物，目前鲜见文献报道。MTT法测定结果表明，4a～4m对HK2细胞没有明显毒性作用。以甜味的NHDC、NarDC、HDC-7-G、三叶苷、蔗糖和苦味的根皮苷作为对照品，用感官法和电子舌分别对4a～4m进行甜味评价。确认4a、4b、4h、4j～4m呈甜味，4d～4g和4i没有甜味，4c呈苦味。对于人感官口尝有甜味的衍生物，电子舌的测定结果与感官评价法基本吻合。基于甜味评价结果，分析了包括5 个二氢查耳酮对照品和13 个衍生物的结构与甜味的相关性。在前人的甜味构效研究基础上探讨甜味分子与受体蛋白的氢键作用对甜味感知的影响。结果表明，二氢查耳酮糖苷的呈味与A环糖基的取代位点有关；与A环的4-糖基（新橙皮糖基/葡萄糖基）没有明确关联，尚取决于B环的取代情况。新橙皮糖苷呈味与B环3’、4’位的取代基有明确关联，B环上2’～6’位无取代，或3’位、4’位仅连有OH、F、Cl之一，可呈甜味。—CH 3 、—OCH 3 不是产生甜味的关键基团。下一步将设计合成更多的二氢查耳酮衍生物，以深入研究其甜味构效关系。
通信作者简介
黄宝华，教授，广东工业大学轻工化工学院化工系教授。1980/09-1984/07，北京大学化学系，理学学士；1986/09-1989/05，暨南大学化学系，理学硕士；2005/09-2011/12，广东工业大学，应用化学，工学博士。1984/07-1986/09，广州医科大学任教；1989/05-1995/01-1999/12，先后任职于广东工业大学实验研究中心和化工系，讲师；1999/12-2007/12，广东工业大学轻工化工学院化工系，副教授；2007/12-现在，广东工业大学，轻工化工学院化工系，天然药物和绿色化学研究所，教授。研究方向：应用化学，绿色精细有机合成，食品化学，味觉智能评价。2019年入选广东省农村科技特派员。2020年入选广东省质监系统科技专家。近年主要从事植物活性成分的评价、生物酶法转化和高值化利用研究，研究系列柑橘黄酮成分及其衍生物的生物活性及其在食品、医药、保健、化妆品和饲料等领域的应用，对柑橘源功能成分和配料的制备技术研发及其产业化有所涉足。先后主持多项省级科研项目，并作为核心成员参与国家基金和省、市级地方创业人才项目。在国内外期刊发表多篇学术论文，获得多项中国发明专利授权。荣获：广东工业大学2019年度“优秀研究生导师”称号；2019年广东梅州高新技术产业园区管委会、广州(梅州)产业转移工业园管委会授予的“梅州高新区广州-梅州产业转移园优秀人才”称号；作为核心成员参与的“柚果全利用技术研发及产业化应用”项目获得2022年梅州市科技局和广东省雁洋公益基金会颁发的“叶剑英基金科学技术进步奖”三等奖。
第一作者简介
黎志豪，男，2015.9-2019.7河南科技大学食品质量与安全专业 学士；2019.9-2022.6广东工业大学轻工化工学院化学工程专业 硕士；2022.6-至今 广东众生睿创生物科技有限公司CMC开发部任职从事药物合成。硕士论文研究方向为食品化学，研究课题为“基于柚皮苷的二氢查耳酮衍生物合成及其评价”，合成了13个糖苷和11个苷元，探讨其结构与甜味的相关性，并探讨糖苷与甜味受体的作用机理。为了筛选出有良好生物活性的二氢查耳酮，分别考察了这些化合物的抗氧化与抗炎活性。以上工作为该类化合物在食品、保健品和医药等领域的产品开发和应用提供科学参考和依据。
本文《基于柚皮苷的甜味二氢查耳酮衍生物合成及其评价》来源于《食品科学》2022年43卷24期83-92页，作者：黎志豪，黄宝华，甄维聪，周金林，卢宇靖。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220317-197。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。
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