电子断层扫描和子断层平均：原位结构生物学
电子断层扫描是解析包含完整细胞区域的纳米级样本的三维结构的重要工具。细胞内部并不规则且拥挤，其内部结构在二维投影图像中会重叠。然而，远非一个混沌不堪的“细胞内容”，细胞内部实则高度有序。冷冻电子断层扫描能够揭示出细胞内部的瞬态超级复合体和长程相互作用，例如，不同细胞机制在病毒工厂中以协调的大型装配方式运作。从倾斜系列数据开始，断层图重构相对直接，尤其是当样品含有用于帮助对齐倾斜视图的基准标记时，因为这些倾斜角度是已知的（图5）。对于倾斜样品的三维散焦校正更为复杂，但可行，如在NovaCTF中实现的那样（Turonova等人，2017年）。
对于独特的物体，不能进行平均，高倾斜时数据的缺失将导致平行于束流方向的平面的特征分辨率较差，但样品平面的特征将得到良好的解析。尽管如此，细胞切片的冷冻断层图可以提供对细胞环境的独特见解，这是其他方法无法达到的尺度。分割被用来识别密度的子区域并帮助解释。这通常需要大量的手动输入，但机器学习的自动化方法正在发展中（例如，在EMAN2中，陈等人，2017年）。最近的方法还使用深度学习来减少断层图中的各向异性（刘等人，2021年）。
如果该部分包含重复结构，如不规则病毒上的刺，或粗糙内质网上停靠的核糖体，这些结构可以被提取并作为全单粒子分析中的三维粒子进行处理，这被称为子断层平均（Castaño-Díez等人，2012年；Himes和Zhang，2018年）。然而，从断层图中挑选粒子包括了一些挑战，如识别膜上的粒子和追踪弯曲的纤维路径。Tegunov等人（2021年）也使用深度学习/神经网络方法，提供了一个显著的证明，即倾斜系列数据中保留了高分辨率信息。对于同一溶液中的同一种类脱铁蛋白样本，在优化了所有对齐和失真校正的工作流程中，单个粒子和倾斜系列数据都达到了2.3埃的分辨率，这个工作流程中包含了Relion和Warp/M软件。对于更厚、更具挑战性的细胞样本，分辨率较低；尽管如此，这些作者还在小型细菌细胞中显示了核糖体的3.5埃分辨率（图6）。为了达到更高的分辨率范围，只有在最终的子断层平均中，每个粒子使用较低的倾斜、较低的电子剂量数据。完整的三维数据集是由许多覆盖全方位的粒子组装的。
验证和原子模型构建
随着该领域的成熟，它已经开始跟随宏观晶体学的实践，发展了标准化的方法来验证结果。尖锐的晶体衍射峰利用局部背景进行信噪比估计，但在噪声图像数据中持续变化的信号的情况下，这不那么直接（陈等人，2013）。无论是电子密度图还是拟合的原子模型都必须通过仍在发展中的方法进行验证。
地图验证
首先，应该检查一些常识性的标准；地图特征应该对样本有意义，应该与图像数据一致，并显示与报告的分辨率一致的细节。最简单的方法是用一个数字来描述地图－分辨率。虽然这给出了一个大致的评估，但这是过度简化的。电子显微镜地图在它们显示结构不同部分的细节水平上可以有很大的差异，例如，由于各向异性和灵活的区域，以及不同质量的地图可以具有相同的名义分辨率。评估电子显微镜地图的分辨率通常是通过将数据集分为两半并独立进行精化，以便可以比较它们的傅里叶变换。它们的三维相关性在分辨率的壳中取平均，得到一条线图，这就是傅里叶壳相关性（FSC）。FSC曲线应该从1开始，因为预计两个半数据集在低分辨率时会匹配，然后以sigmoid形状单调降低到数据的信息限制之外的零相关性。通过对地图进行锐化掩蔽可以引入假的高分辨率相关性。相比于一个单一的、平均的曲线，局部分辨率的估计更有信息量，可以通过根据局部分辨率对地图表面着色来进行视觉呈现（例如，Cardone等人，2013年；Kucukelbir等人，2014年）。
B因子，或温度因子，最初是为了晶体学引入的，用于描述密度的局部不确定性，这可能是由于结构中的混乱，但也可能受到例如图像处理中的不准确等缺陷的影响。B因子校正重新调整傅里叶振幅，以抑制那些模糊更细微细节的主导低频项。这可以在局部基础上完成，以反映局部振幅的衰减（Jakobi等人，2017年）。
对于噪声图像数据，迭代精化可以通过噪声的相关性导致假的高分辨率特征，这被称为过拟合。这可以通过高分辨率噪声替换测试来检测，其中，超过指定分辨率的傅里叶组分的相位被随机值替换（陈等人，2013年）。超过这个分辨率的FSC的非零值表明存在过拟合。
原子模型的拟合和验证
有许多工具可用于将原子模型拟合和构建到冷冻电子显微镜地图中。这主要取决于地图的分辨率，因为分辨率决定了可以拟合的刚体的大小，从低分辨率的整个亚单位或领域，到中等分辨率的二级结构，再到高分辨率的侧链转子，水分子和离子（图7）。如果有一个相关的已知结构，最简单的开始方式是用你的样本的序列构建一个同源模型。AlphaFold2 (Jumper等人，2021)对从头预测结构的巨大成功，对新结构的发现产生了重大影响，而且从神经网络/深度学习方法中可能会出现进一步的进步（例如，Gupta等人，2021）。预测的结构可以用来在复合物中定位新的组分和识别密度，极大地加速了发现。
如前所述，拟合方法取决于分辨率，而这在电子显微镜地图中通常不是均匀的。因此，通常需要对结构的不同部分使用不同的策略。在低分辨率下，这主要限制于将亚单位或领域匹配到密度地图，方法是从模型创建一个密度地图，并将其过滤到电子显微镜地图的分辨率。然后可以通过交叉相关性来评估两个地图之间的对应关系。在低分辨率下，可以通过对原子施加距离约束来将模型拟合到地图中（Croll和Read，2021）。在中等分辨率下，可以在铰链点调整子域或二级结构（例如，使用Flex-EM，Joseph等人，2016），在原子分辨率下，可以进行从头开始的模型构建。一些最初为晶体学中的原子建模开发的程序已经被修改用于电子显微镜地图。主要的不同之处（除了基本的X射线被电子密度分布散射，电子被原子的库仑电势散射）是，晶体学模型被用来精化地图相位（例如，Coot，Refmac，Phenix），而在电子显微镜中，地图是最终的结果，当前的方法只调整模型和地图之间的匹配以最大化模型到地图的密度相关性。其他的标准包括模型几何，它利用肽键和多肽链的已知特性排除不可能的构象，以及避免形成界面的亚单位或领域之间的冲突。
模型验证
模型本身和对地图的拟合都应该被验证，后者使用地图到模型的FSC。最终的评估标准不应该包括用来获取拟合模型的同样的标准。重要的标准包括模型到地图的密度相关性，模型几何，冲突，序列上的局部得分以突出问题区域，以及局部B因子的一致性。在接近原子分辨率的地图中进行建模的最佳程序已经通过使用一小组测试地图的电子显微镜模型任务力量进行了系统评估，他们的建议已经发表（Lawson等人，2021）。
关联光学和电子显微镜（CLEM）
将细胞和分子生物学与结构生物学相结合为新的生物学发现提供了途径。尽管结构生物学在描述大型大分子机器方面非常强大，但这可能会遗漏生物学中的重要特性，如生物体内环境。复杂的功能性或病理性组件在生体内，生体外，甚至在细胞模型系统中都可能不同。细胞生物学可以利用遗传修饰的力量向感兴趣的基因添加荧光蛋白标记，然后可以在完整的细胞或甚至整个多细胞生物中进行跟踪。如上所述，这些系统通常对于直接使用冷冻电子显微镜进行检查太厚，需要使用冷冻切片或者离子束磨削等变薄方法以制作适合电子层析的样品。为了定位感兴趣的区域，需要对荧光和电子显微镜进行相关性分析。冷冻切片可以直接与冷冻荧光进行关联，尽管它们比离子束磨削的薄片保留的结构更差。
在冷冻电子显微镜和冷冻荧光显微镜之间存在很大的分辨率差距，这不易于与需要高光学分辨率的浸入目标结合使用。最低的分辨率是沿着光束方向，使得目标离子束磨削的正确平面变得特别具有挑战性。然而，已经开发了一些冷冻超分辨率光学方法，使得3D目标定位和精确定位在100-300nm范围内成为可能（Tuijtel等人，2019；Moser等人，2019）。已经展示了一个通用的离子束磨削工作流程，包括从高压冷冻样品中提取出来的冷冻CLEM（Klumpe等人，2021）。关联程序需要多个步骤将冷冻样品在荧光，双束扫描电子显微镜/离子束系统和冷冻传输电子显微镜之间转移，每个步骤都有其污染或损坏的风险，并且需要软件来跟踪几何变换以进行精确的目标定位。使用冷冻超分辨率荧光显微镜的关联图像的示例集合显示在图8中。
相关的问题是缺乏一般适用的可以通过遗传方法引入并通过电子显微镜看到的电子密集标签。最近的一种方法是使用DNA折纸创造一个具有独特形状的标记，该标记特异性地结合到荧光蛋白标签上，并且在电子显微镜中容易看到（Silvester等人，2021）。因为它必须被外部添加，所以到目前为止它只能对完整的细胞进行细胞外标记。不同的方法是将质谱法的蛋白质组学数据与冷冻电子显微镜进行关联，这在本卷的文章中有所描述（Klykov等人，2022）。
结论
冷冻电子显微镜正在对结构生物学产生深远的影响，并且越来越影响细胞生物学。图像分类与发展中的时间分辨方法允许探索动态集合的快照，但是对于真正的动态研究，它可以与较低分辨率的视频方法，如荧光或原子力显微镜，结合，以捕获工作生物机器的分子结构。在细胞层面，有很多关于细胞系统之间互动的知识可以学习。冷冻电子显微镜的持续进步为理解细胞机器的装配和操作的协调，以及诸如传输和信号通路等长距离功能提供了新的视角。