胃癌（GC）的高发病率和不良预后使其成为全球第五大最常见癌症和第三大癌症死亡原因。幽门螺旋杆菌感染、饮食问题、饮酒和吸烟等对胃上皮的损伤常常会导致胃癌前病变——解痉多肽表达化生（SPEM）或肠化生（IM），再加上基因多态性和突变的累积，将最终导致疾病发展为更晚期的腺癌【1,2】。尽管TCGA数据库提供了GC中潜在的基因突变谱，但是对于不同基本阶段的时间顺序、单个基因突变的贡献和分子事件仍有许多未知。阻碍目前对导致GC发生和发展的分子事件的剖析的原因之一在于缺乏合适的小鼠模型，虽然现有模型促进了早期GC的研究，但是这些模型很少能发展为转移性癌症，使得无法用于解释疾病进展的潜在机制。
据报道，Cldn18仅在胃肠道内的胃上皮表达。本文研究人员通过实验证实，Cldn18仅在胃的整个腺上皮中强烈表达，包括分别位于幽门部和胃体部的腺体底部的Lgr5+干细胞和储备干细胞群。研究人员通过在内源性Cldn18编码区后插入IRES-Cre-ERT2元件而构建了胃特异性Cldn18-IRES-CreERT2转基因小鼠，该方法保留了内源性Cldn18的表达和功能，从而最大限度地减少了对其作为紧密连接组分的作用的影响。与此同时，研究人员对TCGA数据库中的GC样本进行了基因组和转录组学分析，以评估人类GC中失调的关键通路的患病率，结果发现在GC中，异常调节的WNT和KRAS信号通路之间存在显著重叠（77.9%），而当结合TP53突变时，观察到29.1%同时发生的WNT和KRAS通路活性失调，由此提示这三个通路可能共同驱动了人类GC的发展。
基于以上，研究人员随后将Cldn18-CreERT2小鼠与Apcfl/fl、KrasG12D和/或Trp53fl/fl小鼠杂交，分别获得胃上皮选择性条件性Wnt信号激活、Kras信号激活或条件性Trp53功能丧失的小鼠。实验结果显示，只有单独条件性靶向Apcfl/fl可导致侵犯幽门且转移频率相对较低的管状胃癌；同时，复合靶向Apcfl/fl和KrasG12D突变（AK）可导致整个胃部肿瘤的高效形成，而伴随Trp53缺失的KrasG12D激活（TK）则在胃体部产生更晚期的腺癌（经常扩散至肝脏和胰腺）。由此对每种通路在驱动胃体部和幽门部肿瘤中的作用提出了重要的见解，并强调了由此产生的肿瘤潜伏期的变化。进一步地，为了获得更真实的转移性GC条件模型，研究人员将Apc条件等位基因突变（ApcWT/fl）、KrasG12D和Trp53fl/fl突变引入胃上皮，获得ApcWt/flKrasG12DTrp53fl/fl（Cldn18-ATK）小鼠，该小鼠胃体部浸润性肿瘤形成的频率很高，且伴随高转移率（图1）。
图1
随后，研究人员分析了Cldn18-ATK小鼠肿瘤与人类正常和肿瘤样本转录组之间的相关性。结果显示，与正常组织相比，Cldn18-ATK侵袭性肿瘤与人类肿瘤之间的相关性更强，而瘤形成期Cldn18-ATK上皮与人类正常组织转录组的关系更为密切。将人类肿瘤样本中上调的差异表达基因（DEG）与侵袭性和瘤形成期Cldn18-ATK转录组之间的DEG进行比较，发现了TCGA和Cldn18-ATK队列中有157个DEG和20个GO注释通路的重叠。与此同时，对Cldn18-ATK肿瘤及其伦理上合适的终末期转移的组织学分析显示，其特征类似于人类GC的T3-T4期，并伴有淋巴结转移。通过IHC对Cldn18-ATK肿瘤和转移灶与人类GC的详细比较显示，两者在组织学特征和通路激活状态方面具有高度相似性。由此表明Cldn18-ATK可以精确模拟晚期人类腺癌。
Lgr5是包括胃在内的各种组织中的上皮干细胞标记物，Lgr5+干细胞是上皮细胞癌（包括结肠癌和胃癌）的来源，而胃肠道癌症中的肿瘤驻留Lgr5+（TR-Lgr5+）细胞群可作为肿瘤干细胞驱动疾病的发展。本文研究人员将Lgr5-DTR-GFP（5DTR）等位基因整合到上述转移性小鼠模型（Cldn18-LATK）中，在可视化内源性TR-Lgr5+干细胞样细胞（TR-Lgr5+ SC）的同时促进其选择性消融，从而用来评估TR-Lgr5+ SC在GC进展的各个阶段中的作用。实验结果显示，在疾病开始的早期阶段，TR-Lgr5+ SC丰度显著增加，到肿瘤形成期达到峰值。之后，随着病情的发展，其相对丰度逐渐下降。同样的，侵袭区域也驻留了Lgr5+细胞群，其丰度在疾病发展期间下降。随后，研究人员对Cldn18-LATK小鼠给予他莫昔芬诱导，2个月后给予白喉毒素（DT），每周1次，持续2周，以在侵袭和转移开始之前去除原发性肿瘤中的TR-Lgr5+ SC。与DT未处理小鼠相比，DT处理小鼠的原发性肿瘤显著缩小，侵袭性肿瘤和肝转移几乎消失。由此确定了TR-Lgr5+ SC在促进GC进展和转移发生中的关键作用。然而，仅仅短暂的急性消除TR-Lgr5+ SC时却不能长期改善肿瘤生长，因为虽然在肿瘤中消除TR-Lgr5+ SC能在一开始有效减少原发肿瘤负担和转移，但肿瘤通过快速生成新的TR-Lgr5+ SC进行补偿，从而比未经DT处理的肿瘤更能促进肿瘤的形成和扩散。不过，研究人员证实在已建立的胃癌中持续且频繁地消耗TR-Lgr5+ SC能非常有效地改善疾病的进展。最后，考虑到胃癌固有的通过可塑性机制（包括过度增殖）部分补偿TR-Lgr5+ SC急性丢失的能力，研究人员发现联合TR-Lgr5+ SC消除和常规化疗（5-氟尿嘧啶）可以更有效地阻断GC生长和转移（图2）。
图2
最后，为了避免体内全身消除正常Lgr5+ SC相关的毒性，研究人员采用了一种将肿瘤类器官原位移植（OT）到免疫缺陷NOD-Scid-Gamma（NSG）小鼠胃黏膜下层的模型。实验结果表明，该OT模型中的肿瘤和转移再现了内源性肿瘤的组织学和分子特征。将Cldn18-LATK小鼠模型中的消除TR-Lgr5+ SC的策略同样应用到OT模型中，也能得出类似的结论。此外，比较未经DT处理（Lgr5+）和经DT处理（Lgr5-）的肿瘤类器官在经脾脏注射到NSC小鼠后产生肝脏和肺转移的能力发现后者几乎无转移，提示TR-Lgr5+细胞负责播散转移。
综上所述，本研究描述了一种可以有效且选择性地针对胃肠道内胃上皮的所有隔室进行基因重组的Cldn18-IRES-CreERT2等位基因，利用在此基础上构建的晚期GC模型，确定了TR-Lgr5+ SC对体内GC的发生、进展和转移具有重要贡献，突出强调了开发靶向人类内源性TR-Lgr5+ SC群的治疗药物的巨大临床潜力。毫无疑问，这些模型对于旨在进一步定义GC进展的潜在临床相关机制、确定更有效的诊断和治疗方法以及用于临床前筛查应用的研究具有重要意义。
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参考文献
1. Tan, P. & Yeoh, K. G. Genetics and molecular pathogenesis of gastric adenocarcinoma. Gastroenterology 149, 1153–1162.e3 (2015).
2. Grabsch, H. I. & Tan, P. Gastric cancer pathology and underlying molecular mechanisms. Dig. Surg. 30, 150–158 (2013).
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