摘要根据中医经络学说,耳为宗脉之所聚,六阳经都直接或间接地上耳前或耳中,六阴经则通过与阳经的络属关系,间接地与耳发生联系。脏腑的生理或病理活动均可通过经络反映于耳。足三里是胃经的合穴,也是下合穴,“合治内府”,是治疗胃腑病的常用首选穴位,具有和胃健脾,降逆调中之功。大量临床和动物实验观察均证实针刺“耳胃”穴及“足三里”穴对胃溃疡有明显疗效。但其治疗的作用机理至今尚未甚明,以致影响防治效果。<br>目的:研究电针“耳胃”及“足三里”穴治疗实验性胃溃疡过程中,穴区肥大细胞(mast cells,MCs)和腹腔MCs(Peritoneal MCs,PMCs)的功能变化与疗效的相关性。<br>方法:实验均采用清洁级Wistar大鼠,雌雄各半,由中国医学科学院实验动物中心提供。<br>①形态学及电生理学实验:将40只大鼠(体重150-220g)随机分为对照组、模型组、电针组和模型测导电量组(简称导电量组)。后3组首先采用1ml注射器在胃窦前壁肌层与浆膜层之间注入0.05ml20％冰醋酸的方法制作胃溃疡模型。电针组动物在手术后4h电针(2/15HZ,1mA,30min)双侧“耳胃”穴和“足三里”穴,电针前用HB-EDT-A穴位诊断治疗仪(河北威海医用电子仪器有限公司)测定1次“耳胃”穴导电量,然后隔2h再测定1次。以后每天电针前测定1次,至造模后7d。导电量组大鼠在胃溃疡造模术后不进行电针,但耳穴测定与电针组同时进行。7天后分别取4组大鼠“耳胃”及“足三里”穴区组织恒冷箱切片,乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AchE)组化染色并用甲苯胺兰(toluidine blue,TB)复染,显示穴区真皮至皮下组织MCs的分布、数量和脱颗粒情况。取胃窦前壁含溃疡胃组织石蜡包埋,切片后行苏木精一伊红(hemotoxylin-eosin,HE)染色。<br>②PMCs的收集和培养及流式细胞仪检测:<br>a PMCs的收集及离心:40只大鼠(体重约200g)经麻醉,腹部去毛,消毒后,切开腹部,在无菌条件下收集腹腔冲洗液,并离心(1000r/min,4℃)10min,弃上清液,取其细胞悬液,沿管壁缓慢加入盛有PMCs分离液的离心管中,使两液形成界面,然后离心(2500r/min,4℃)15min,弃上清液,取底部PMCs,用冷的无Ca2+、Mg2+的PBS离心清洗2次(1000r/min4℃)共20min,弃上清液。<br>b PMCs的培养和血清的制备:取底部PMCs,TB染色,光镜下计数,调PMCs浓度至106个/ml,PMCs纯度大于95％以上,台盼蓝染色,活力大于95％,并置于含10％小牛血清的RPMI-1640孵育液中悬浮备用<br>将30只大鼠(体重约200g)随机分为对照组、模型组和电针组(3组大鼠的相应处理均按照形态学实验中的方法,但电针组不再测耳穴导电量),7天后分别在3组大鼠的颈动脉取血,将血液移入离心管中,37℃下静置2h,在常温下离心(2500r/min)10min,用吸管小心吸取血清,将同组血清混合,过滤除菌,分装后-20℃冻存备用。<br>c PMCs脱颗粒率的流式细胞仪分析:在PMCs悬液中,分别加入3组大鼠的血清(PMCs悬液与血清之比为1:1),置37℃、5％CO2培养箱内共孵育2h,4℃终止反应,用冷的无Ca2+、Mg2+的PBS离心清洗2次(1000r/min4℃)共10min,弃上清液,取底部PMCs,用100μl Anncxin-V荧光标记液(1ml孵育缓冲液+20μlAnncxin-V荧光标记素+20μl Propidium碘化液)悬浮,并在15-25℃孵育10-15min,采用ELITE-型流式细胞仪计数Annexin V荧光阳性细胞数(即为PMCs的脱颗粒率)。<br>结果:<br>①形态学实验:对4组大鼠的穴区真皮至皮下组织MCs进行对比观察,其中模型组MCs总数量均明显多于导电量组、电针组和对照组,导电量组MCs总数量又明显多于电针组和对照组,电针组又多于对照组。统计学处理结果显示,4组间存在非常显著性差异(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。通过对各组穴区内MCs脱颗粒率进行统计学处理,结果表明模型组MCs脱颗粒率明显高于导电量组、电针组和对照组,导电量组细胞脱颗粒率也明显高于电针组和对照组,电针组高于对照组,且4组间均存在非常显著性差异(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。<br>HE染色结果显示:对照组胃窦前壁粘膜面完整无缺损；而模型组胃窦前壁粘膜面有很明显的溃疡缺损,已明显超过粘膜肌层；电针组胃窦前壁粘膜面稍有缺损,尚未达粘膜肌层；导电量组胃窦前壁粘膜面的溃疡缺损介于模型组与电针组之间。<br>②电生理学实验:导电量组及电针组大鼠术后“耳胃”穴导电量皆较手术前显著升高,电阻值降低。但电针组于第1次电针后导电量即不再升高,维持在术后第1次测定的水平；导电量组大鼠术后耳穴导电量却继续升高,并持续3～5天,第6天后开始下降；两组的耳穴导电量升高从第1次电针后即表现出组间显著性差异,第7天后才逐渐接近。<br>③PMCs脱颗粒率的流式细胞仪检测:模型血清组PMCs的脱颗粒率明显高于电针血清组和对照血清组,电针血清组PMCs的脱颗粒率明显高于对照血清组,统计学处理结果显示3组间均有非常显著性差异(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。<br>结论:<br>①在穴区MCs较多,并多沿神经和血管分布,特别在小血管周围较密集,说明MCs确实与穴位反应和针刺效应相关。<br>②相关穴区MCs数量及脱颗粒率的变化与实验性胃溃疡的发生呈正相关性,这为体表脏腑相关的理论提供实验依据。<br>③电针治疗实验性胃溃疡的作用,与穴区MCs的数量减少和脱颗粒率的降低密切相关,针刺血清对PMCs脱颗粒有直接抑制作用,表明针刺效应的产生与神经、免疫和体液等多种因素有关。<br>④MCs与穴位低电阻有一定相关性,为临床应用耳穴诊治相关疾病提供了可参考的科学依据。
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