为了回答哪些特点使得黏膜免疫的效果与系统性免疫不同,人们需要对黏膜免疫的组成及功能进行深入的分析。总体上讲,黏膜免疫系统包含黏膜上皮细胞、特化了的上皮细胞如M细胞(membrane/microfold cell)、上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte,IEL)、黏膜相关淋巴组织(mucosal-associated lymphoid tissue,MALT)等组分,是全身免疫系统的组成部分但又相对独立(Molloyetal.,2012)。为了寻求更有效的黏膜免疫干预策略,有必要首先认识黏膜免疫区别于系统性免疫的特点。
(1)在组成上,黏膜免疫由弥散在黏膜上皮内或黏膜下固有层的大量免疫细胞、免疫分子、单个或多个淋巴滤泡聚集成的黏膜相关淋巴组织(MALT)等组成。
黏膜相关淋巴组织包括肠相关淋巴组织(GALT)、支气管相关淋巴组织(bronchial-associated lymphoid tissue,BALT)和鼻相关淋巴组织(nasal-associated lymphoid tissue,NALT)等。GALT 由孤立的及聚集的淋巴滤泡组成(Neutraetal.,2001),这里是抗原识别及免疫应答起始的地方。聚集的淋巴滤泡常见于派尔集合淋巴结(Peyerpatches,又称Peyer小结)、阑尾等部位。GALT是全身最大的淋巴组织,包含人体约70%的免疫细胞。
从形态上,Peyer小结包括三个功能区：滤泡区、副滤泡区和滤泡相关上皮(follicle-associated epithelium,FAE)(Neutraetal.,2001)。滤泡区、副滤泡区组成Peyer淋巴滤泡,含有一个生发中心及B淋巴细胞、滤泡DC、巨噬细胞。滤泡相关上皮是由一层肠上皮细胞以及特化的上皮细胞--M细胞组成(OwenandJones,1974)。FAE覆盖Peyer小结,形成肠腔微环境与肠淋巴系统的界面。
(2)分泌型免疫球蛋白[如sIgA(secretory IgA)]在黏膜免疫防御中发挥重要作用。
sIgA在肠腔内抗原诱导下,由局部黏膜免疫组织合成,并经上皮细胞分泌到黏膜表面。sIgA在保护机体免受黏膜表面的微生物侵袭方面起着非常重要的作用,其合成与淋巴细胞归巢迁移以及周围环境中的细胞因子均有很大关系(Strober,1990；Boyaka,2017)。
(3)常激活抑制性T细胞。
黏膜免疫系统进化出了一系列的机制维持对食物、益生菌等无害抗原的耐受。如肠道菌发酵多糖后产生的短链脂肪酸可促进抑制性Treg细胞的扩增活化,并分泌IL-10等抑制性细胞因子,进而维持黏膜免疫耐受。
(4)黏膜免疫按功能分为两个不同的部位：诱导部位及效应部位。
诱导部位包括黏膜外表面的上皮细胞、M细胞以及免疫组织网络如肠相关淋巴组织(GALT)、支气管上皮和下呼吸道相关淋巴组织、鼻咽相关淋巴组织、喉相关淋巴组织(LALT)等,是黏膜免疫反应的主要诱导位点,是免疫应答的穿入区。诱导部位主要负责抗原的捕获、处理和提呈,激活免疫细胞,诱导免疫应答。
效应部位主要由弥散的免疫细胞,包括上皮内淋巴细胞(intraepithelia lymphocyte,IEL)、固有层淋巴细胞(lamina propria lymphocyte,LPL)、天然淋巴样细胞(innatelymphoid cell,ILC)和一些外分泌腺(如唾液腺)组成,主要负责对抗原的应答。
(5)免疫细胞在诱导部位及效应部位间的循环是黏膜免疫的重要特征。
黏膜免疫系统在诱导部位及效应部位间，主要通过淋巴细胞归巢发生联系,即一个诱导部位致敏的免疫细胞进入血液循环逐步分化成熟。在特异性归巢受体(homing receptor)的介导下,80%的致敏免疫细胞回到致敏部位进行效应性应答,其余进入其他黏膜部位。
当外来抗原侵入机体时,宿主发动相关的淋巴组织作用于抗原,使抗原暴露在含有大量免疫活性细胞的诱导部位,并激活抗原特异性的B细胞、T细胞。这些激活的B细胞、T细胞从诱导部位迁出,经过血液循环或淋巴循环归巢到远处的效应部位,在呼吸道、胃肠道、生殖道黏膜及唾液腺等黏膜效应部位引起相关联的免疫应答。所以将黏膜诱导部位到效应部位这一系统称为共同黏膜免疫系统(common mucosal immune system,CMIS)。
另外,黏膜免疫后IgG抗体形成细胞主要进入血液循环归巢至系统淋巴结或组织的炎症部位,而IgA抗体形成细胞归巢至黏膜部位。最近研究表明,这两种细胞还可归巢至骨髓,调节血清中抗体的形成。
近年来,一些黏膜免疫细胞如肠上皮细胞(intestinal epithelia cell,IEC)、M细胞、上皮内淋巴细胞等诱发黏膜免疫反应的机制及其应用引发人们的关注。病原微生物抗原或用于免疫的疫苗抗原,均需要通过上皮细胞、M细胞或黏膜相关淋巴组织内抗原提呈细胞的吞噬、转运、呈递等过程完成免疫应答的诱导,其后则是活化了的特异性免疫细胞的归巢及对抗原的应答(Brandtzaeg,2009)。
在黏膜免疫反应过程中,IEC被认为是一种特殊的抗原提呈细胞。IEC可表达MHC-I类分子、MHC-II类分子和非经典的I类分子。体外及体内实验显示,IEC能从消化道摄取大分子和一些有机体(如轮状病毒、沙门氏菌和螺旋杆菌等),并以由高尔基体出芽成的运输小泡和胞吞作用形成的内体合并形成的溶酶体(内体性溶酶体)的形式运输到基底侧。IEC不同于经典APC的特征在于其抗原提呈功能受炎症状态的调节：肠腔中有很多抗原存在,但IEC提呈抗原的功能在很大程度上取决于肠道的炎症状态。IEC对非炎症状态下黏膜免疫抑制的维持及炎症状态下免疫系统的激活都十分重要。IEC与淋巴细胞相互作用后是维持免疫耐受状态还是导致炎症的发生,取决于多种免疫细胞间相互作用的结果。
近几年,对IEC与T细胞相互作用的研究较多,提出的假设也较多：非炎症状态下,IEC主要经过非经典的I类分子CD1d和gp180提呈抗原,激活的CD8*T细胞为抗原非特异性免疫抑制性细胞,未激活CD8CTL反应。而且,非炎症状态下,IEC不表达共刺激信号CD80和CD86,因此,肠黏膜T细胞处于无能或耐受状态。
炎症状态下,IEC的MHC-II类分子表达增高,并表达共刺激信号CD86。而且正常情况下,IEC仅从游离面摄取抗原,炎症时抗原可能由于紧密连接泄漏而到达基底侧。由于运输的方式不同,可导致不同的免疫反应。在体外,IEC与T细胞的共培养系统中,IEC能选择性地激活CD8*T细胞,且两者通过非经典的CD1d分子或/和gp180结合(Dahan et al. , 2007)。
除此之外,M细胞在抗原摄取、转运中的作用,IEL在黏膜免疫效应阶段的作用,以及它们在黏膜疫苗开发中的意义也是近年来研究的热点(Kimet al.,2012；Hathaway and Kraehenbuhl,2000)。无论是识别诱导部位还是效应应答环节,均有大量的不同种类的免疫细胞参与。认识这些免疫细胞参与黏膜免疫反应的机制是黏膜免疫研究的核心问题。
黏膜免疫细胞归巢循环的过程最能体现黏膜免疫的运行规律,黏膜免疫细胞随着从诱导部位到效应部位的归巢过程而逐步分化成熟。黏膜免疫细胞归巢的机制也是黏膜免疫研究的重要内容(Brandtzaeg,2009)。大多数淋巴细胞最终归巢到效应部位的黏膜固有层或上皮内,少数归巢到其他黏膜部位及一些外分泌腺。淋巴细胞的归巢及淋巴细胞表面的归巢受体,与黏膜免疫系统局部微环境表达的不同配体之间的相互作用有关,还与黏膜免疫系统中局部特异性表达的趋化因子及胞外基质等因素有关。
不同淋巴细胞表达的归巢受体可能不同,而有些黏附分子在内皮细胞的表达也呈现组织特异性,如GALT中的高内皮静脉(HEV)及肠固有层中的扁平静脉,均可表达黏膜地址素细胞黏附分子(mucosal addressin cell adhesion molecule-1, MAd-CAM-1)(Yuetal.,2012),而正常人的扁桃体、肺外分泌腺体、唾液腺、乳腺及周围淋巴结的HEV等几乎不表达MAdCAM-1。将未转化的人小肠微血管内皮细胞在体外培养几天后,可丧失MAdCAM-1的表达,之后也不能诱导其表达,却能诱导血管细胞黏附分子(VCAM-1,CD106)的表达。由于VCAM-1在健康者及炎症患者体内的肠黏膜中均不能被检出,因此在肠微环境中可能存在一些可抑制VCAM-1表达而促进MAdCAM-1表达的因子。
免疫细胞移行一般由选择素黏附分子介导而产生可逆性起始黏附,再由活化的整合素介导而稳定黏附于内皮并渗出。如在Peyer小结中,致敏淋巴细胞将最终归巢到肠黏膜或肠黏膜外效应部位。淋巴细胞若表达归巢受体α4β7,则该分子可与表达于Peyer小结中HEV及固有层中扁平静脉上的MAd-CAM-1相互作用,分别介导未致敏细胞迁入Peyer小结和致敏细胞归巢到黏膜固有层；而表达αEB7的致敏细胞则通过与黏膜上皮细胞表达的αEB7受体E-钙依赖黏附素(E-cadherin)相互作用而定居于黏膜上皮内,成为上皮内淋巴细胞(IEL)。
趋化因子致敏细胞归巢后,如何贮留在局部黏膜系统发挥免疫效应?
有研究发现,一些组织特异性表达的趋化因子与淋巴细胞渗出后定位并贮留在各种淋巴组织的微环境有关。例如,次级淋巴趋化因子优先表达于周围淋巴结中T细胞区的非淋巴细胞及Peyer小结中的滤泡旁区,并优先吸引T细胞归巢。相反,B细胞趋化吸引物(BLC)则高表达于Peyer小结、周围淋巴结和脾中的滤泡区。其受体(BLR1)基因敲除鼠的B细胞不能进入滤泡区,但能正常进入T细胞区域。研究表明,整合素在黏膜免疫系统中是与归巢有关的关键的黏附分子,此外,选择素也参与了归巢过程(Gorfuetal.,2009)。
近几年已发现几类黏附分子参与了淋巴细胞的归巢与定居,其中主要是整合素分子。整合素是I型跨膜糖蛋白,由αβ亚基组成,参与细胞之间的黏附。目前至少已鉴定了15个α亚基与8个β亚基,可配对形成20多个整合素分子。
β链可与几个不同的α链结合,据此可将整合素分成不同的亚家族。β1亚家族由B1及α1一α9相连而成,其配基多为细胞外基质,如纤维黏连蛋白。B2亚家族包括aLB2、aMB2和aXB2,主要表达于淋巴细胞等白细胞表面,其配体为Ig超家族成员,如ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3,在淋巴细胞的再循环中起作用。最近又鉴定了几个新β链,如B4、B5、B6和B7。B7选择性表达于淋巴细胞上,分别与α4及αE结合形成α4β7和aEB7,构成 B7亚家族,由于它们参与黏膜淋巴细胞归巢与定居而引起注意。几种重要的黏膜细胞归巢相关分子总结如下。
(1)整合素 α4B7及配体MAdCAM-1。
已知α4B7是小鼠淋巴细胞归巢到黏膜组织的主要受体。α4B7主要表达于循环B细胞及一些循环记忆性CD4*T细胞上,针对它的抗体可阻断小鼠淋巴细胞结合到Peyer小结内的高内皮静脉(HEV)。Williams发现,表达 α4B7及CD44hish的记忆T细胞可以非常有效地归巢到Peyer小结,而α4B7记忆T细胞基本上不能进入黏膜淋巴组织,它们主要归巢到外周淋巴结(Williamsetal.,1997)。
Farstad研究了人体Peyer小结中T细胞、B细胞上的α4β7分布发现,HEV附近CD45RA*T细胞及滤泡中SIgD*B细胞表达中等水平的α4B7和丰富的L-选择素,而靠近输出淋巴管的记忆性CD45RO*T细胞和SIgD~B细胞则表达高水平的α4B7,很少表达L-选择素。由于α4B7和L-选择素共同表达于Peyer小结HEV附近的淋巴细胞,表明两者参与了人淋巴细胞归巢到肠相关淋巴组织(GALT)的过程(Farstad et al.,1994)。
α4β7的主要配体为MAdCAM-1,次要配体为内皮VCAM-1及纤维黏连蛋白(FN)。MAdCAM-1属于Ig超家族,为50KD1的跨膜糖蛋白。它有4个结构区,第1区和第2区为Ig区,有 a4B7结合位点,第3区是黏蛋白样区,有选择素结合位点。MAdCAM-l主要在肠Peyer小结、肠系膜淋巴结的HEV、肠固有层小静脉和乳腺小静脉内皮表达,因此 α4B7主要介导淋巴细胞归巢到这些黏膜淋巴组织。
(2)整合素 aEB7及其配体E-钙依赖黏附素(E-cadherin)。
αEB7主要在肠上皮内淋巴细胞及肠固有层淋巴细胞高水平表达,在部分外周血淋巴细胞也表达,其中B细胞表达水平高于T细胞。有人发现,αEB7也在支气管上皮内淋巴细胞及肺泡壁淋巴细胞表达。约50%的肺泡记忆T细胞表达αEB7,可介导特定T细胞亚群在支气管上皮定居。
免疫沉淀分析表明,αEB7由135KD的α链与100KD的β链组成。目前 αE与B7的基因已经被克隆。关于αEB7的功能,体外实验表明,抗αEB7单抗可阻断T细胞黏附于上皮细胞,因此它主要介导上皮内淋巴细胞(IEL)黏附及定居于肠上皮。用一组针对上皮细胞的单抗可以阻断IEL与上皮的黏附,证明αEB7的配体是上皮细胞表达的E-钙依赖黏附素(E-cadherin)(Cepek et al.,1994)。
钙依赖黏附素是另一类黏附分子,有5个细胞外区,尾部与连环蛋白(catenin)及肌动蛋白相连。在固体组织形成过程中,钙依赖黏附素可介导Ca2t依赖的同型的细胞黏附,其特点是有严格的组织特异性表达。E-钙依赖黏附素主要在上皮细胞基底面表达,可识别IEL的αEB7,介导IEL与上皮细胞黏附,有助于淋巴细胞归巢到黏膜部位。转染实验表明,用αEB7基因转染Cos细胞后,被转染的Cos细胞可结合上皮细胞,这种结合可被针对 aEB7或针对E-钙依赖黏附素的单抗所阻断。另外,α4B1(VLA-1)也介导淋巴细胞在内皮上的滚动,参与淋巴细胞归巢。已发现大多数肺部T淋巴细胞表达α4β1。
(3)L-选择素。
L-选择素主要介导淋巴细胞归巢到外周淋巴结,但也参与淋巴细胞归巢到黏膜淋巴细胞,如Peyer小结,因为针对L-选择素的单抗也可部分阻断淋巴细胞归巢到Peyer小结。幼稚淋巴细胞表达的L-选择素与HEV内皮表达的MAdCAM-1糖基部分相互作用,导致淋巴细胞在内皮上滚动,然后 a4B1与MAdCAM-1进一步相互作用,抑制滚动,淋巴细胞即可穿过内皮进入淋巴结内。可见L-选择素在淋巴细胞起始黏附及沿内皮滚动中起重要作用(Kobayashietal.,2012)。
对于已进入肠固有层的淋巴细胞,从固有层向上皮的迁移是由上皮细胞分泌的化学趋化因子驱动的,如IL-8。由于α8B7的次要配体为纤维黏连蛋白,故在淋巴细胞穿过固有层的细胞外基质向黏膜上皮的运动中起作用。上皮细胞还可合成TGF-B1,诱导淋巴细胞表达αEB7,通过 aEB7与肠上皮基底面表达的E-钙依赖黏附素结合,从而将淋巴细胞固定于上皮内。
归巢后淋巴细胞的功能是黏膜免疫研究的核心问题。尽管效应部位也包括一些相关的外分泌腺体,但对效应部位的研究主要集中在黏膜内及黏膜固有层的T细胞。它们与别的细胞及微环境的相互作用,直接调节着黏膜免疫反应,也是黏膜免疫研究的核心问题。
效应部位的T细胞在黏膜免疫反应及平衡中,有很多功能上尚未完全阐明的、异型的T细胞参与。在肠黏膜,肠上皮细胞(IEC)可与两类T细胞紧密接触——上皮内淋巴细胞(IEL)和固有层淋巴细胞(LPL)。
IEL：表达αEB7与IEC上的E-钙依赖黏附素结合,定位于IEC之间,是体内最多的免疫细胞,平均每5~6个IEC中有1个IEL。75%的IEL为gdT细胞,远高于外周血(5%)。
近年用转基因鼠证明,部分IEL是胸腺外发育成熟的T细胞。IEL能以非MHC限制的方式直接识别未加工的抗原产生溶细胞活性,作为机体早期抗感染的机制。另外,部分IEL可表达FasL,并以Fas依赖的方式介导IEL凋亡,清除被感染的肠道上皮细胞而发挥抗病毒作用(Cheroutreetal.,2011)。
LPL：由比例几乎相同的T细胞和B细胞组成。T细胞中约2/3为CD4*T细胞,1/3为CD8*T细胞,主要是活化的T细胞。IEC通过基底膜孔隙与LPL的不同细胞亚群直接紧密接触。
上述归巢后的淋巴细胞是黏膜免疫效应阶段的主要介导者(Dahanetal.,2008)。
在认识黏膜免疫反应特点及规律的基础上,如何将这些特点及规律用于疾病的防治是人们最为关心的问题。对黏膜疫苗的研究而言,尽管人们知道黏膜疫苗有诸多的优点,但遗憾的是,截至目前,有效的黏膜疫苗十分有限。迄今为止,除了脊髓灰质炎口服疫苗外,几乎没有黏膜疫苗被有效地用于人。轮状病毒黏膜疫苗和流感黏膜疫苗在短期应用后,由于其副反应已从市场撤回,这表明,黏膜疫苗的研究仍有许多值得深入探讨的课题。当前一些黏膜疫苗研究进展如何、遇到了何种问题等,是未来仍要探讨的问题。
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