淋巴细胞是免疫系统的重要组成部分，可帮助身体抵抗感染或消除病变细胞。由T细胞和B细胞组成的淋巴细胞不断在体内巡逻，以识别非正常细胞，包括肿瘤细胞。
随着肿瘤的生长，淋巴细胞将其细胞识别为异常并渗透到肿瘤中，即肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。由于TIL 直接来自肿瘤组织，因此它们已经识别出癌细胞上的许多特异性抗原。而对比来说，CAR-T或者TCR-T必须经过基因工程才能识别一个或两个抗原。
应对实体肿瘤的高度异质性，TIL细胞表达了更丰富的肿瘤反应性克隆，从而赋予了TIL疗法治疗实体瘤的独特优势。
究竟什么是TIL疗法？相对比CAR-T，TCR-T，CAR-NK疗法，TIL疗法有何优势与局限？倚锋资本将从VC/PE的角度出发，全面解读TIL疗法。
1.1 肿瘤的本质
当一个细胞产生了肿瘤转化，会开始出现克隆性增殖，同时衍生出众多亚克隆，其中具有强侵袭性、更能避开宿主反应的亚克隆存活下来并进行大量疯狂的繁殖。
图源：《病理学第9九版》
1.2 肿瘤微环境
肿瘤微环境(TME)是肿瘤产生和生活的环境，其组成复杂，包括通常包括异质性的肿瘤细胞以及其周围的免疫细胞、基质细胞、细胞外基质(ECM)、分泌的细胞因子、胞外囊泡和相互交织的血管、淋巴管网络。TME参与抗肿瘤过程中的免疫逃逸、原发及获得性耐药、放射抵抗，进而促进肿瘤的复发和进展。
图源：Frontiers in Oncology
T细胞
免疫检查点可以负性调节免疫系统，避免免疫系统过度激活。阻断该过程可释放抗肿瘤免疫潜能。目前常用的免疫检查点分子包括CTLA4、PD-1、TIM3、LAG3和TIGIT。
树突状细胞DC
DC是一组抗原呈递细胞(APC)，可向T细胞呈递抗原从而启动特异性免疫过程。TME可以通过多种途径负向调节DC的功能，从而抑制T细胞激活，诱导免疫耐受。靶向DC的靶点包括FLT3L，GM-GSF和DC疫苗。
肿瘤血管
肿瘤血管与正常血管相比形态扭曲而功能异常，这种异常结构导致瘤内低氧环境，妨碍药物和免疫细胞进入肿瘤内。目前针对肿瘤血管的治疗策略包括抑制肿瘤血管生成、脉管正常化和增加药物的渗透能力。
细胞外基质ECM
图源：Bejarano, Jordao& Joyce, CancerDiscovery (2021)
1.3 靶向肿瘤微环境的治疗策略
图源：Joyce,Johanna A. 'Therapeutic targeting of the tumor microenvironment.' Cancercell 7.6 (2005): 513-520.
2.1 TIL疗法
TIL疗法的效应细胞是经过天然选择与富集,肿瘤特异性T细胞比例高且多样性丰富的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。其迁移到肿瘤并浸润肿瘤，可识别肿瘤特异性抗原，是引发直接和间接细胞活性的淋巴细胞群。
TIL细胞由CD8+T细胞，CD4+T细胞，γδT细胞，B细胞，NK细胞等组成。杀伤性主要通过细胞毒性CD8+T细胞（CTLs）实现，机制包括直接靶向抗原的细胞毒性（IFNγ，颗粒酶，穿孔素），纯株增殖和记忆形成。其治疗本质依赖于机体内生的免疫系统来对抗肿瘤。
图源：Cancer Res; 72(13); 3125–30. © 2012 AACR.
2.2 TILs疗法的主流制备方式
（1）得到患者的肿瘤组织块，其中混杂着体积较大的肿瘤细胞以及体积小而圆的T淋巴细胞；
（2）将T细胞从肿瘤组织分离，将不同种类的T淋巴细胞在细胞板上克隆化，并加入高浓度的IL-2来选择培养，培养后仅免疫细胞可存货；
（3）在IL-2的刺激下，不同种类的T淋巴细胞都得到了克隆扩增，形成了细胞群；
（4）用患者的肿瘤细胞和扩增后的T淋巴细胞反应，凡是能够发生杀瘤效应的T淋巴细胞群作为阳性TIL群留下，其余的丢弃；
（5）用负载了肿瘤特异性抗原的树突状细胞(DC)进一步扩增培养肿瘤特异性的TIL；
（6）最后，回输给预先做了清髓的肿瘤患者。
图源：Miltenyi Biotec
丰富的临床数据证明，现代的TIL疗法是一种有效的、可行的实体瘤治疗方法：
图源：CHUM presentation
应对实体肿瘤的高度异质性，TIL细胞表达了更丰富的肿瘤反应性克隆(包括TAAs，CGAs和TSA)：
肿瘤内异质性(intra-tumorheterogeneity, ITH)一直是癌症治疗的难题。ITH越高，越容易耐药，癌症进展越快，预后越差。这就像生态系统一样，越多样越强大，越不易消亡。
图源：Burrell(2013).Nature.
目前肿瘤抗原主要分为肿瘤特异性抗原(TSA)和肿瘤相关抗原 (TAA)。TSA表达于肿瘤细胞而不存在于正常细胞的抗原，TAA则不仅在肿瘤组织表达，在正常细胞上也有微量表达。
实体瘤通常与多种肿瘤特异性抗原(TSA)有关。然而，即使在相同的肿瘤类型下，也只有不到1%的患者共享相同的TSA。
图源：Front. Immunol., 03 March 2022
3.1TIL疗法
相较而言，TIL具有更多样化的TCR克隆、优异的肿瘤定位能力，以及高安全性。
3.2 CAR-T和TCR-T简述
TCR-T和CAR-T都是过继性T细胞疗法的前沿技术，他们将一个可以结合肿瘤抗原的靶向分子插入到患者的T细胞中，然后再将工程化的T细胞回输给患者，TCR-T和CAR-T的靶向分子都会使T细胞靶向肿瘤细胞。
但这二者的抗原识别机制不同，因此它们在功能上也有一定的差异。CAR-T的CAR结合的是细胞表面上的抗原，其大的优势是不需要依赖于MHC的抗原递呈，有效避免了肿瘤细胞MHC表达下调这一免疫逃逸机制。而TCR-T的TCR可识别由主要组织相容性复合体呈递在细胞表面的肽。
图源：National Cancer Institute
CAR-T治疗实体瘤方面受到疗效和安全性挑战：
（1）实体肿瘤的抗原异质性
CAR-T只能识别肿瘤细胞表面的抗原，而对于在细胞内表达的肿瘤相关抗原“无能为力”——但肿瘤细胞有将近90%的细胞蛋白是位于细胞内。从肿瘤抗原的特异性来说，除了突变产生的靶抗原外，如EGFRviii，CAR-T很难找到只在肿瘤细胞表面表达而不在正常组织表达的安全的靶抗原；这严重限制了CAR-T细胞的用量，使其无法达到有效的治疗剂量。
针对实体瘤的CAR-T 细胞疗法靶抗原大多是TAA；这导致CAR-T细胞输注后很难正确找到攻击对象，在发生治疗作用时极易“敌我不分”伤及无辜，从而产生严重副反应甚至危及患者生命。因此实体瘤中缺乏TSA是CAR-T细胞免疫疗法疗效不佳的主要原因之一。
（2）CAR-T细胞的归巢障碍
CAR-T细胞的归巢障碍是指CAR-T细胞不能顺利经过血液系统运输至实体瘤组织内部产生治疗作用。
由于CAR-T对抗原的亲和力太强，容易聚集在肿瘤组织表面，造成T细胞耗竭，因此难以进入肿瘤内部扩增并发挥杀伤作用，对实体瘤的杀伤效果有限。通用型CAR-T细胞也面临制备难度较高、以及较高的潜在临床风险。
图源: Current OpinioninPharmacology 2021, 59:70–84
3.3TCR-T在治疗实体瘤方面面临的优势和局限
（1）优势
TCR-T细胞可识别细胞膜表面或细胞内来源的肿瘤特异性抗原，可以靶向大部分的肿瘤特异性抗原，尤其是能识别那些肿瘤细胞内抗原。因此TCR-T细胞治疗的靶点范围更广，更有潜力冲破实体瘤的坚固防线。
此外，TCR-T在实体瘤中已经显示出初步效果，在国内外治疗难治复发性黑色素瘤、滑膜肉瘤、多发性骨髓瘤和肺癌等临床试验研究中，已经展示了良好的安全性和有效性。
图源：Current Opinionin Pharmacology 2021,59:70–84
（2）局限
TCR-T的未来开发挑战包括：(1)靶向正常组织引起的免疫毒性；(2)工程化T细胞中TCR表达不足或短暂表达；(3)T细胞耗竭和功能障碍；(4)肿瘤免疫逃逸；(5)大多数癌症患者缺乏有效的肿瘤特异性抗原作为靶点。
此外，由于TCR-T识别抗原依赖HLA的递呈，而人体中的MHC种类繁多，不同个体的抗原表达也有差异，临床可用的TCR序列受限。
TCR必须与患者的人类白细胞抗原(HLA)等位基因匹配才能识别pMHC并杀伤癌细胞。因此对于不同的人群，筛选合适的HLA配型是非常重要的事情。
虽然TCR-T可以针对所有肿瘤抗原，但是目前已经证明安全、有效的靶点十分有限，也面临靶点扎堆的风险。其中最多的是NY- ESO，占到开发总量的37%;筛选合适的亲和力阈值也是一个难题。高亲和力的TCR可以增强免疫反应，但过强的亲和力也会损伤到T细胞；
同时，在质控、安全性方面，TCR-T脱靶产生的毒性反应尤其值得关注。因为外源TCR与内源TCR链间的错配，会带来不确定性和安全性风险。当TCR-T靶向的抗原不只在肿瘤上表达时，就会产生肿瘤靶向的瘤外毒性(on target off tumor toxicity)。
Parkhust等在转移性结直肠癌中使用了以CEA作为靶点的高亲和力TCR-T进行治疗，尽管所有接受治疗的患者血清中的CEA水平均下降，但有3例患者出现了危及生命的结肠炎和结肠出血，试验被迫终止。
一项以MAGE-A3为靶点的TCR-T治疗临床试验中，9例MAGE-A3高表达的患者(包括转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤和食管癌)中5例患者在治疗后获得了局部反应；2例患者由于脑组织中表达的MAGE-A12含有与MAGE-A3类似的肽序列，导致TCR-T在大脑中产生交叉反应，出现严重的脑灰质损伤，最后死亡。
倚锋资本制图
3.4 TIL疗法：主要挑战
TIL疗法单次输注的细胞数量约为100亿，在短时间内将TIL扩增到这个数量级对工艺要求极高，扩增难度相比于CAR-T疗法更难。
其次，TIL细胞已经天然归巢到肿瘤组织一次，在细胞生命进程上倾向于耗竭，而在体外扩增过程中要逆转这种耗竭状态，恢复细胞活力。
为改善TIL细胞耗竭问题，主流方法会给予患者多达6剂IL-2以促进活化、增殖和抗肿瘤细胞溶解 TIL 的活性。而IL-2的大量使用所连带的副作用导致患者的生存质量下降。
TIL制备效率较低，平均耗时为60-100天，这也为TIL规模化生产带来困难。
同时，TIL疗法涉及了临床手术、生产制造、运输等多个方面，在各个流程中的标准制定难度极大，这也成为TIL疗法发展过程中必须解决的问题。
图源：Miltenyi Biotec
Iovance目前正在拓展TIL联合PD-1疗法，表达PD-1的TIL亚群，快速制备TIL（16天）等研发管线。
Instil Bio利用慢病毒转染，使TIL自身表达相应共刺激信号，解决免疫微环境中共刺激信号不足的问题，对应的CoStAR-TIL能够更加高效地杀灭肿瘤。
Achilles与Turnstone通过基因测序分析获得肿瘤特异性抗原信息，合成抗原肽刺激DC，与TIL联合提升免疫活性和疗效。
Obsidian的cytoTIL15在培养过程中使用病毒载体向T细胞内转导可控的膜结合IL-15基因，使TIL同时具有表达IL-15的能力，从而在治疗过程中免除了IL-2的使用。
Cell Squeeze技术与TIL的联合，通过mRNA和TIL的共同挤压，能够不利用其他载体使TIL具有合成IL-2和IL-12的能力，避免TIL治疗过程中IL-2的使用，提升TIL疗效和安全性。
Intima利用CRISPR-cas9技术敲除(KO)TIL中CISH基因。
Lyell和Thyas通过山中因子的短暂表达，能够在不改变T细胞特性的同时，恢复T细胞干性，维持TCR克隆组成。
适应症市场：全球90%的肿瘤类型是实体瘤，TIL疗法是目前全球治疗二线及以下实体瘤客观缓解率非常高的治疗方法，市场潜力巨大。
赛道龙头：今年以来，Iovance已收到了FDA对其效力分析和专有细胞共培养分析组合的积极反馈，首个TIL疗法产品预计于2022 Q3年递交BLA申请，将有望成为全球第一款获批上市的治疗实体肿瘤的细胞治疗药物。近期Institl Bio宣布，其首个基因工程共刺激抗原受体肿瘤浸润淋巴细胞（CoStAR-TIL）疗法ITIL-306获得FDA的临床许可，显著减少清淋化疗的剂量，且输注后无需IL-2支持。
进入壁垒：TIL疗法核心技术难度在取材不易、产品稳定生产的工艺体系复杂，及运输等等环节，对公司核心创始人有极高的工业体系经验及临床资源要求，同业竞争相对较少。
参考文献：
[1]Paijens, Sterre T., et al. 'Tumor-infiltrating lymphocytes in the immunotherapy era.'Cellular & molecular immunology 18.4 (2021): 842-859.
[2]Joyce, Johanna A. 'Therapeutic targeting of the tumor microenvironment.'Cancer cell 7.6 (2005): 513-520.
[3]Wang, Shuhang, et al. 'Perspectives of tumor-infiltrating lymphocyte treatment in solid tumors.'BMC medicine 19.1 (2021): 1-7.
[4]Creelan, Benjamin C., et al. 'Tumor-infiltrating lymphocyte treatment for anti-PD-1-resistant metastatic lung cancer: A phase 1 trial.'Nature medicine 27.8 (2021): 1410-1418.
[5]Savas, Peter, et al. 'Clinical relevance of host immunity in breast cancer: from TILs to the clinic.'Nature reviews Clinical oncology 13.4 (2016): 228-241.
[6]Chen, Daniel S., and Ira Mellman. 'Elements of cancer immunity and the cancer–immune set point.'Nature 541.7637 (2017): 321-330.
[7]“TCR-T vs CAR-T----谁更有可能攻克实体瘤”公众号：细胞与基因治疗领域
[8]“TIL疗法：解密产业化过程”公众号：星耀研究院
[9]“基因改造产品IND获批，TIL迎来新时代？——TIL细胞改造技术盘点”公众号：华赛伯曼