Bali Pulendran
美国斯坦福大学病理学、微生物学和免疫学教授
研究方向：
微生物群对疫苗接种免疫反应的调节：意义和潜在机制
微生物群对人类疫苗免疫的影响
疫苗免疫学
背 景
1.1 背景
20世纪20年代以后的70多年里，铝盐(明矾)一直是被人们认可的唯一的佐剂。
在20世纪90年代末，油包水乳剂佐剂MF59首次使用。
此后的20年里，出现了其它四种佐剂。
1.2 背景
20世纪90年代末，人们发现Toll样受体通常在树突状细胞(DCs)上表达，并识别高度保守的病原体相关分子模式(PAMPs)，导致DCs的激活，从而刺激抗原特异性的T和B细胞反应。在Toll样受体发现后的十年里，其他的先天性模式识别受体（PRR）他们也可以影响适应性免疫。靶向这些受体的分子也被用作潜在的疫苗佐剂。
1.3 背景
虽然最近的研究取得了重大的进展，但是我们对在疫苗中使用的佐剂如何发挥实际作用的机制理解仍不充分。
有研究对佐剂的作用机制展开了讨论，有证据表明，树突状细胞和其他先天免疫系统的细胞不仅可以被病原体通过PRRs激活，还可以被组织损伤激活，组织损伤导致损伤相关分子模式(DAMPs)的释放， 诱发适应性免疫。在这篇综述中，讨论目前使用的佐剂，其次，我们讨论了佐剂作用的免疫学机制的几个新兴概念。
佐剂的分子靶点
2.1 TLRs
Toll样受体TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6表达于细胞表面，TLR3、TLR7、 TLR8、TLR9表达于核内体。
2.2 Cytosolic PRRs
2.维甲酸诱导基因I (RIG-I)和黑色素瘤分化相关蛋白5 (MDA5)是细胞内病毒传感器，通过干扰素调节因子3（IRF3）和IRF7驱动I型干扰素反应。
3.环磷酸鸟苷-腺苷合成酶（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）通路识别双链DNA (dsDNA)诱导NF-κB通路，产生1型干扰素。
2.3 CLRs
c型凝集素受体(CLRs)是表达于多个髓系细胞亚群的细胞表面分子。
几种常用佐剂的机制
3.1 明矾
明 矾
最常用的佐剂，在人体中诱导抗体应答和CD4+ 辅助T细胞应答。
作用是通过一种与TLR信号通路无关的机制发生的。
还可通过引起组织损伤，诱导尿酸介导的炎症性树突状细胞活化，从而增强适应性免疫。注射明矾后迅速招募包括中性粒细胞在内的各种细胞，中性粒细胞释放由染色质组成的细胞外杀菌网络(NETs)。NETs中释放的DNA部分介导了明矾的佐剂活性。
3.2 MF59
MF59是一种水包油乳剂佐剂，这种佐剂包含角鲨烯油滴，它是一种可生物降解的生物相容性油，是人体的正常成分。
在肌肉中用MF59会激活骨髓细胞（如巨噬细胞和DC），这些细胞通过产生趋化因子如趋化因子配体2（CCL2）、CCL4、CCL5等，进而将中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和更多的单核细胞和DC募集到注射部位，这些细胞进一步放大反应并迁移到引流淋巴结以激活B细胞和T细胞。
将MF59佐剂流感疫苗肌肉注射到小鼠体内，导致ATP的瞬时细胞外释放，局部注射三磷酸腺苷双磷酸酶（一种ATP水解酶），抑制了细胞募集和抗原特异性CD4+T细胞反应以及由MF59诱导的抗体反应，表明MF59佐剂疫苗诱导的ATP瞬时释放介导了适应性免疫反应。
有研究证明MF59辅助抗体应答依赖于MyD88，而不依赖于NLRP3炎症小体激活。然而，MF59并没有激活表达TLR的HEK293细胞系的TLR信号，这使作者得结论，MF59通过独立于TLR的MyD88依赖性机制诱导抗体反应。
将含有MF59佐剂的H5N1亚单位疫苗免疫接种到具有细胞凋亡相关斑点样蛋白（ASC)基因缺陷的小鼠中，观察到特异性IgG抗体滴度低于野生型小鼠中特异性IgG抗体，但是，在敲除NLRP3炎性体的小鼠体内应答是完整的，由此，作者得出结论，MF59佐剂依赖ASC，但不依赖炎症小体途径诱导抗体反应。
用MF59加抗原对小鼠进行皮下免疫会通过依赖于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(RIPK3)的机制刺激抗原特异性CD8+T细胞反应。RIPK3缺陷产生抗原特异性CD8+T细胞反应的能力受损，这种反应在缺乏混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)的小鼠中是正常的，这表明在RIPK3缺陷小鼠中观察到的CD8+T细胞反应受损是通过一种独立的机制发生的。
3.3 AS0佐剂系统
AS0佐剂系统将经典佐剂分子（包括明矾、乳剂和脂质体）进行合理组合，并与免疫刺激分子联合使用（如TLR 配体等）。
AS0佐剂系统
AS04
AS04由3-o-脱酰基-4′-单磷酸脂a(MPL)组成，这是一种从沙门氏菌中提取的一种脂多糖(LPS)，吸附在铝盐上。
小鼠研究表明，MPL吸附在明矾上时，AS04的辅助作用是通过对固有细胞的TLR4信号介导的。
AS03
AS03是一种角鲨烯水包油型乳剂佐剂，与MF59类似，但还含有α-生育酚（维生素E）作为额外的免疫增强成分
α-生育酚的作用：调节某些趋化因子和细胞因子的表达，增强单核细胞的抗原摄取，并增加粒细胞在引流淋巴结的聚集
AS03增强了抗体反应和CD4+T细胞反应的幅度和广度，与非佐剂疫苗相比，增强了人体对流感的抵御能力
在人类中，在接种AS03佐剂的H5N1禽流感疫苗24小时内，血清中IL-6和CXCL10水平升高，干扰素信号的转录以及树突状细胞、单核细胞和中性粒细胞中的抗原加工和呈递也增加
AS01
佐剂AS01是两种不同免疫刺激成分的组合，这两种成分分别为：MPL和QS-21。在AS01中，MPL和QS-21在有胆固醇存在的脂质体中共同配制。胆固醇的作用为将QS-21结合到脂质体中并抑制其反应原性。
MPL通过TLR4激活先天免疫系统，主要是通过TRIF依赖性信号传导。此外，小鼠研究表明，QS-21在引流淋巴结的被膜下淋巴窦巨噬细胞(SSMs)中激活半胱天冬酶1（caspase 1）。
两个单独分子的组合对于AS01的完全佐剂作用至关重要，因为TLR4、半胱天冬酶1的缺失会损害佐剂效应，因此，AS01的一个显着特征是产生协同作用以诱导新的途径，这些途径不是单独由任一成分触发的，该途径可能与IFNγ相关，因为在体内阻断IFNγ会消除MPL和QS-21的协同作用。
3.4 胞嘧啶磷酸鸟苷1018
TLR9激动剂CpG 1018是一种22聚体未甲基化的CpG-B类寡核苷酸，是一种有效的 TH1细胞佐剂，可刺激B细胞和NK细胞活化。TLR9有三类CpG寡核苷酸配体，它们可以通过不同的核苷酸序列基序和它们在浆细胞样DC中刺激IFNα的能力来区分。
CpG分子的免疫刺激能力取决于它们是以单体形式还是多聚形式出现，单体CpG-B寡核苷酸定位于溶酶体相关膜蛋白1 (LAMP1)阳性核内体，并促进浆细胞样DC成熟，但很少或不产生IFNα。
当聚合成微粒时，CpG-B定位于转铁蛋白受体1 (TFR1)内体，并通过TLR9依赖性机制导致IFNα的产生。此外，单体CpG-B可以很容易地被B细胞吸收并刺激它们的活化。相比之下，CpG-A由于其回文结构自发形成纳米颗粒状复合物，也定位于浆细胞样DCs中的TFR1内体，刺激IFNα的产生，但不能被B细胞摄取。
CpG引起免疫反应的机制也依赖于CpG的形式，用可溶性CpG-B加抗原免疫小鼠，通过依赖于DC中TLR9介导的MyD88激活的机制诱导CD4+T细胞和抗体反应。相反，使用聚合形式的CpG-B加抗原进行免疫很少依赖于DC中的MyD88信号传导，因此认为有其它细胞在聚合形式的CpG-B引发免疫反应的过程中发挥了作用。
疫苗中的新兴概念
4.1 佐剂在CD8+T细胞反应中的作用
佐剂可以增强人体对疫苗接种的抗体反应，但迄今为止，还没有能够诱导与黄热病和天花等活病毒疫苗刺激的抗原特异性CD8+ T细胞强度相当的佐剂。因此，目前需要解决的一个重要问题是是否有佐剂可以模拟活疫苗在人类诱导CD8+T细胞反应方面的效力。
经研究发现，亚单位疫苗，即使与有效的佐剂一起递送，也不会在人类中诱导CD8+T细胞反应；DNA的疫苗和重组病毒载体仍然不能达到活病毒载体诱导的CD8+ T细胞应答的大小。
最近使用mRNA技术的COVID-19疫苗试验结果表明，人类中CD8+ T细胞应答水平很高。在辉瑞mRNA疫苗的I/II期试验中，CD4+ T细胞和RBD特异性CD8阳性T细胞的平均数量约每百万外周血单核细胞(PBMC)700和400个。通过细胞内细胞因子染色，RBD特异性CD8+ T细胞的频率非常高，一些接种者的RBD特异性CD8+ T细胞的频率高达T细胞总数的4%。
人们认为组织驻留记忆T细胞(Trm细胞)，永久驻留在组织中，并提供抵抗病原体的一线防御。Trm细胞定位于屏障部位，在再次感染时能迅速作出反应。当病原体进入粘膜部位时，识别病原体的Trm细胞迅速被激活，并刺激局部微环境中的邻近细胞激活并招募免疫细胞，建立抗病毒状态。因此，我们目前还可以开发能够诱导高剂量Trm细胞的佐剂。
4.2 不仅只有DC细胞参与佐剂诱导的免疫反应
有明确的证据表明，DC对TLR配体的佐剂活性至关重要。因此，在DC缺陷的小鼠中，TLR配体的佐剂活性严重受损。然而，免疫系统是一个复杂的网络，有研究强调其他细胞类型在此过程中发挥了关键作用。
MF59诱导肌细胞释放ATP对其佐剂活性至关重要。此外，直接刺激B细胞是产生持久的浆细胞反应的一个重要的因素。因此，在B细胞中缺乏TLR信号的小鼠在用TLR配体加抗原进行免疫时产生抗体的能力严重受损。另外，有研究表明B细胞内在的MyD88信号对于刺激抗原特异性B细胞是必不可少的。因此，我们应该更全面地讨论不同细胞类型协调适应性免疫反应的机制。
4.3 不仅只有TLR参与佐剂诱导的免疫反应
过去，对于佐剂的研究重点一直集中在TLR通路，但有研究发现，有其它的模式识别受体来实现佐剂效果。通过模式识别受体发出信号会导致局部组织和细胞损伤，由此释放的DAMPs是几种佐剂活性的关键组成部分。
STING和RIG-I通路的配体是刺激小鼠较强CD8+T细胞反应的潜在佐剂。
最近有研究表明，环状RNA在体内激活IRIG-I，可用作佐剂来诱导抗体反应。
4.4 代谢、细胞死亡和表观遗传学
在过去的十年中，人们逐渐认识到先天免疫系统不仅可以通过PRRs感知微生物，而且还能够感知各种组织损伤和应激信号。
由外伤、感染和自身免疫引起的组织损伤会导致多种DAMP的释放。
组织损伤可由外伤、自身免疫或感染引起，并导致细胞死亡和细胞外释放大量DAMP，如ATP或尿酸，或DNA或RNA片段或高迁移率族框1(HMGB1)，它可以激活DCs以刺激适应性免疫。
有证据表明，在小鼠中，明矾会导致细胞死亡并随后释放宿主细胞DNA，宿主DNA在反应中充当DAMP。此外将MF59佐剂疫苗注射到小鼠体内会刺激细胞外释放ATP，通过局部注射腺苷三磷酸双磷酸酶 对其进行抑制会减弱免疫反应。
细胞死亡佐剂
细胞死亡也已成为免疫反应的关键调节因子。有研究表明，DC也可以从凋亡细胞中获取抗原，从而激活CD8+T细胞，这种现象叫抗原交叉致敏。
细胞坏死的机制为：坏死由受体相互作用蛋白激酶1 （PIPK1）介导，RIPK1自磷酸化并招募蛋白激酶3（RIPK3）, RIPK3的激酶活性介导坏死 。但死亡细胞产生的DAMPs并不能有效激活CD8+T细胞，交叉致敏需要RIPK1信号通路和NF-κB信号通路的协同作用。例如，用MF59加抗原免疫小鼠会导致淋巴结巨噬细胞坏死和抗原特异性CD8+T细胞的激活。
细胞坏死或焦亡后，激活CD8+ T细胞的过程:细胞坏死或焦亡后，释放组织损伤相关分子模式，激活树突状细胞，经过溶酶体逃逸、蛋白酶体讲解、MHC-1类分子提呈等过程激活CD8+ T细胞。
代谢佐剂
近年来，有研究表示骨髓细胞（如巨噬细胞和DC）的代谢状态可以影响它们刺激T细胞的能力。DC细胞在不同的成熟状态、不同的组织，具有不同的代谢状态。例如，中枢代谢调节因子mTOR复合物在介导TLR诱导的浆细胞样DC分泌I型干扰素方面起主要作用。并且，还可以影响髓样DC中IL-12的分泌。
氨基酸传感器调控阻遏蛋白激酶2 （GCN2）可以调节骨髓细胞的功能及其诱导T细胞反应的能力。例如，黄热病毒疫苗YF-17D刺激DC中的GCN2活化，促使抗原呈递给CD8+和CD4+T细胞。这些结果表明DC中代谢调节剂可以影响免疫反应。
表观遗传佐剂
有人提出，髓细胞，如单核细胞和巨噬细胞或NK细胞，在用PAMP刺激后获得类似记忆的特征。疫苗（如BCG）和PAMP（如β-葡聚糖）在单核细胞和巨噬细胞中诱导组蛋白H3在Lys4（H3K4me3）处三甲基化和H3在Lys27（H3K27ac）处乙酰化，这些变化在消除刺激后持续数周，导致表观遗传状态增强。在与相同或不同的PAMP二次刺激，这种增强的状态诱导基因表达的增强。
用疫苗免疫会导致树突状细胞摄取抗原，然后由疫苗中所含的佐剂激活抗原，活化的DC将抗原呈递给T细胞区域中的幼稚抗原特异性CD4+T辅助细胞( T H 细胞)。一些活化的 T H 细胞上调细胞表面趋化受体5（CXCR5）和去化因子受体7，使它们迁移到B细胞滤泡和T细胞区域之间的界面，在那里它们表达IL-21和CD40L，刺激抗原激活的B细胞的克隆扩增。一些抗原特异性B细胞迁移到髓索并分化为短寿命的浆细胞，但其他活化的B细胞迁移到B细胞滤泡中形成生发中心(GC)。GC中的B细胞随后可以分化为再循环的记忆B细胞，或迁移到骨髓的长寿浆细胞(LLPC)。
4.5 佐剂的持续作用 背景
免疫学的一个主要模式是先天免疫反应在感知到微生物之后快速做出反应，并对随后的适应性免疫产生影响。但是，有研究发现，佐剂信号在后期阶段可能直接影响适应性免疫细胞，如B细胞。GC B细胞竞争在滤泡树突细胞(FDC)上表达为免疫复合物的抗原，优先选择那些对抗原具有最高亲和力的细胞，并分化为迁移到骨髓的记忆B细胞或LLPC。因此，潜在的新佐剂靶点可能包括GCs中的B细胞亚群、骨髓LLPCs。
4.6 免疫原性取决于环境
免疫系统对给定的佐剂或疫苗作出的反应，在很大程度上取决于环境。特定群体中的个体或地理上不同的群体中的个体的免疫状态可能因基因、环境或微生物的差异而不同。
在世界不同地理区域的人群中，疫苗诱导免疫可能存在差异。例如，与欧洲或者美国相比，针对脊髓灰质炎、轮状病毒、疟疾和黄热病的疫苗对非洲和亚洲人口的效果欠佳。这一现象可能是微生物群组成的差异所造成的。
最近的一项研究表明，使用广谱抗生素去杀死人类的微生物群会显著降低没有接种流感疫苗或获得流感的人群的流感疫苗的h1n1特异性结合抗体反应和中和滴度。这表明，在接种流感疫苗时，微生物群提供了一些内源性佐剂信号，说明我们可以将微生物群作为疫苗佐剂。这方面的例子是益生菌在疫苗接种和免疫治疗中的应用，但由于研究规模相对较小，结果一直不稳定。
4.7 佐剂配方
佐剂配方
合成分子与天然产物
已建立的配方与创建新配方
目前有几种配方方法用于佐剂中包括铝盐、乳剂和脂质体，他们作为抗原和佐剂的有效“输送系统”，开发这些传递系统的一个主要挑战是将其使用于人类身上。最近，发现了新型TLR7激动剂，将其吸附在了明矾上，吸附在明矾上的TLR7有潜在的安全性，并且对人类具有良好的耐受性。
确保成分的必要性
确保每个组成部分都是必要的，并明确每一个成分的价值，同时不引入不合理的成分。
系统疫苗学
5.1 传统疫苗的研究方法
传统方法研究疫苗的过程 ：佐剂的开发一直依赖于对小鼠候选分子的系统测试，将有希望的候选分子推进到灵长类动物模型中，并最终在人类中进行测试。在所有的佐剂中，在动物模型中显示出巨大的免疫原性和有效性，但只有少数佐剂是真正安全有效的。产生这种差异的原因可能是进化的差异导致的，所以在佐剂测试中利用人体模型的必要性。
系统疫苗学研究为疫苗反应提供了许多新的机制见解 ，例如，TLR5的表达在接种后几天内被诱导，并与几周后的抗体反应密切相关216。随后的小鼠实验显示，在TLR5缺失的小鼠中，对接种季节性流感疫苗的抗体反应受损。这可能是由于来自肠道菌群的鞭毛蛋白通过TLR5信号传递，并提供辅助信号来增强抗体应答，因此，用广谱抗生素治疗或者接种流感疫苗后，抗体反应受损。
此外，系统疫苗学方法不仅可以用来确定佐剂的作用机制，还可以用来确定配方起作用的潜在机制，疫苗接种后不久发生的不良反应的潜在机制，以及合理设计最佳疫苗输送配方。
5.2 系统疫苗学研究方法
基于系统疫苗学提出的佐剂设计和迭代测试模型，加速临床佐剂的发现和开发：首先在小鼠、类器官上进行测试，然后在灵长类动物身上进行研究，再进行小规模的人体试验，再用生物学的方法进行分析，可以产生关于免疫和反应原性机制的新假说，同时可以将佐剂运用于大规模的人体试验，在这些过程中会产生以生物学见解为指导的新型佐剂的设计，再运用到动物中，直到找到最适合人类的佐剂。
参考文献：Pulendran, B., S. Arunachalam, P. & O’Hagan, D.T. Emerging concepts in the science of vaccine adjuvants. Nat Rev Drug Discov 20, 454–475 (2021).
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