为深入了解组蛋白及其衍生肽在贻贝免疫过程中的作用，实验采用荧光定量PCR(qPCR)技术对厚壳贻贝组蛋白H2A 和H2B 进行微生物胁迫后的表达量变化进行分析。在此基础上，对厚壳贻贝组蛋白H2A 和H2B 基于其N 端序列设计的衍生肽段 (分别为Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ)进行固相化学合成、圆二色性光谱分析以及抑菌活性验证。结果显示，厚壳贻贝组蛋白H2A 和H2B 在不同组织中，对不同微生物胁迫均产生明显的表达量上调，且在血细胞中表现出对真菌和革兰氏阴性菌的敏感性，在鳃组织中表现为对革兰氏阳性菌的敏感性；而在消化腺组织中，H2A 对革兰氏阳性菌较为敏感，但H2B 对真菌和革兰氏阴性菌较为敏感。厚壳贻贝组蛋白衍生肽段Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ在非极性溶液中，其螺旋含量明显上升，且二者对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有明显的抑菌活性，但Coruscusin-Ⅱ对真菌的抑制活性较Coruscusin-Ⅰ强。进一步的螺旋结构预测结果表明，2 种衍生肽序列中碱性氨基酸的种类及分布特征可能是其抑菌活性差异的内在原因。本研究为了解组蛋白及其衍生肽在贻贝免疫过程中的作用及其机制奠定了基础，也为开发贻贝组蛋白衍生肽为来源的新型生物抗生素提供了科学依据。
关键词: 厚壳贻贝；组蛋白；组蛋白衍生抗菌肽；固相化学多肽合成
组蛋白是一类参与真核生物染色质组装和转录调控，同时又具有重要免疫功能的蛋白质[1]。目前，已报道的真核生物组蛋白包括H1～H5 共5大类，其中H2 又分为H2A 和H2B，与H3 和H4一起构成核小体组装的核心结构[2]。H1/H5 则负责核小体之间的连接[3-4]。组蛋白通常富含碱性氨基酸，其中，H1 和H2 往往富含赖氨酸，而H3 和H4 富含精氨酸，其所带正电荷会对原核细胞富含负电荷的细胞膜造成损害，因此，组蛋白是一类潜在的具有抗菌活性的蛋白质，其在真核生物免疫中的重要作用已有报道[5-6]。组蛋白衍生抗菌肽(HDAPs)正是在这一背景下被首次从中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)中发现，该蟾蜍中的HDAP 是一种由39 个氨基酸组成的多肽，裂解自其体内H2A 组蛋白，被命名为Buforin Ⅰ[7]。随后，又从同物种中发现BuforinⅡ，一种由21 个氨基酸残基组成的多肽，同样是裂解自H2A，具有广谱抗菌活性[8]，且其作用机制在于可透过细菌细胞膜，并结合原核生物DNA 而发挥抗菌效果[9]。对于HDAP 在生物体内的发生机制，目前普遍认为，完整的组蛋白在生物体遭受细菌入侵时，通过胞内的酶解机制被裂解，并释放至胞外发挥抑菌活性。例如，BuforinⅠ被认为是蟾蜍胃壁细胞中，由胃蛋白酶同工酶在组蛋白H2A 序列的Try 39～Ala 40 位置，经过裂解并释放出相应肽段，即BuforinⅠ[10]。而在鲇(Parasilurus asotus)中，其HDAP(被命名为ParasinⅠ)是由组织蛋白酶在其组蛋白H2A 序列的Ser 19～Arg 20 位置产生裂解，继而释放至其皮肤黏液中发挥抗菌活性[11]。
目前，多数已报道的HDAPs 均发现于脊椎动物，特别是鱼类中，HDAPs 被认为是鱼类抗菌肽家族的重要一员[12]。而在无脊椎动物中，关于HDAPs 的报道较少，仅在少数甲壳类以及软体动物中被鉴定，包括凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) [13]、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii) [14-15]、锯缘青蟹(Scylla paramamosain) [16]以及软体动物中的栉孔扇贝(Chlamys farreri) [17]和皱纹盘鲍(Haliotis discus discus) [18]等。此外，在美洲牡蛎(Crassostrea virginica)中已报道了具有抑菌活性的完整组蛋白H2B[19-20]。以上研究表明，组蛋白在无脊椎动物的免疫体系中可能也发挥了重要作用。
贻贝是一类具有重要经济价值的双壳贝类。与其他贝类相比，贻贝在养殖过程中表现出对疾病的较强耐受性[20-23]。值得关注的是，在当前抗菌肽研究中，贻贝抗菌肽表现出较强的分子多样性和广谱的抗菌活性，已报道的贻贝抗菌肽家族目前已超过10 种[24]，这使得贻贝成为海洋生物中发现抗菌肽数量最为丰富的物种之一，其丰富的抗菌肽种类也为开发贻贝抗菌肽为来源的新型生物抗生素提供了一个资源宝库。尽管HDAPs 在少数其他贝类中已有相关报道，但是贻贝中至今尚未发现其体内HDAPs 的存在，也不清楚组蛋白在其免疫防御过程中的作用。考虑到贻贝对疾病较强的耐受性以及贻贝抗菌肽的多样性，贻贝体内可能也存在类似的HDAPs，并参与了贻贝的免疫防御过程。因此，针对贻贝HDAPs 的研究，将有助于拓展对HDAPs 在无脊椎生物中的认知，了解HDAPs 在贻贝免疫体系中的作用及其机制。
1 材料与方法
1.1 厚壳贻贝组蛋白H2A 和H2B 的序列及qPCR 分析
根据厚壳贻贝H2A 和H2B 基因序列中开放阅读框设计特异性引物(表1)，利用qPCR 技术开展基因表达分析。厚壳贻贝的细菌诱导实验参照文献方法进行[29]：对厚壳贻贝进行不同微生物诱导，包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)和白色念球菌(Candida albicans)。诱导后分别于0.5、1、2、4、8、12、24、48 和72 h 采集厚壳贻贝鳃、消化腺以及血淋巴组织；其中，血淋巴经离心 (1 500×g,10 min,4 °C)后获得血细胞。对以上组织进行总RNA 提取和逆转录，所得组织cDNA 作为模板开展后续qPCR 分析。实验过程中操作人员严格遵守实验动物相关伦理规范。
表1 荧光定量PCR 研究的特异性引物
qPCR 在实时定量PCR 系统(MX3000P,Stratagene 公司，美国)中进行。荧光染料为SYBR Green。PCR程序设置为95 °C 预变性180 s，95°C 变性20 s，59 °C 退火20 s，72 °C 延伸25 s，循环数为35。特异性引物及内参基因引物见表1。相对表达量采用2-ΔΔCt 方法[30]进行分析。采用3 次重复实验，数据以平均值±标准差表示；所得数据以SPSS 软件(v25.0)的One-Way ANOVA方法进行显著性分析，P＜0.05 代表具有显著差异。
1.2 厚壳贻贝组蛋白H2A 和H2B 衍生肽段的设计与化学合成
Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ的多肽固相化学合成参照文献[33]，在十二通道半自动多肽合成仪(上海强耀生物科技有限公司)上合成，合成方向为从羧基端向氨基端。合成后的线性多肽粗品以高效液相色谱仪(Agilent 1260,美国)进行分离纯化，色谱柱为 C18 反相柱 (Kromasil 100-5,4.6 mm×250 mm，5 μm)，洗脱液分别为含0.1% TFA的纯水(A 液)和含0.1% TFA 的乙腈(B 液)；其中，Coruscusin-Ⅰ合成产物的洗脱梯度为25 min 内B液比例由0%上升到100%；Coruscusin-Ⅱ合成产物的洗脱梯度为25 min 内B 液比例由15%上升到40%；流速均为1.0 mL/min；采用紫外检测器进行检测，检测波长为 280 nm。收集洗脱目标峰开展质谱分析，采用质谱仪 (Agilent-6125B,美国安捷伦公司)对合成后的多肽纯品进行精确分子量鉴定，质谱检测条件：气动辅助电喷雾离子化(ESI)，毛细管电压为 4.5 kV，检测器电压为 1.5 kV，离子源温度为250 °C，离子检测方式为选择性离子检测，离子极性为正离子。
采用复性液(0.05 mol/L Tris-Hcl 缓冲液，含1.5 mmol/L 还原型谷胱甘肽、0.15 mmol/L 氧化型谷胱甘肽及0.05mol/L NaCl，pH 值8.6)对Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ在多肽浓度为0.5 mg/mL时复性24 h。复性后的 Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ经脱盐及纯化后，开展抑菌活性实验。
1.3 抑菌活性测试
1.4 圆二色性光谱分析
参照文献[35]的方法，将Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ分别溶解于纯水、PBS (10 mmol/L)和30% (体积百分比)三氟乙醇(2,2,2-Trifluoroethanol，TFE)溶液中，配置成100 μg/mL 浓度；上样圆二色性光谱仪(JASCO J715 型，日本)采集CD 谱；采集温度设置为298 K，扫描波长范围设置为190～260 nm；波宽为1.0 nm，步长为0.1 nm；扫描速率为20 nm/min；二级结构含量参照文献[36]方法计算。
2 结果
2.1 厚壳贻贝H2A 和H2B 的序列特征
衍生肽段Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ序列以方框标注所在区域，* 代表终止密码子。
结构域预测结果表明，H2A 蛋白序列中无信号肽，其结构域主体为H2A 结构域(5～125 位氨基酸残基所在肽段，编号为SM000414) (图2-a)，此外无其他可预测的结构域。H2B 蛋白序列中同样无信号肽，其序列中主体结构域为H2B(26～122 位氨基酸残基所在肽段，结构域编号为SM000427) (图2-b)。此外，其序列中还含有一段low complexity region (LCR，4～20 肽段) (图2-b)，其特征表现为富含赖氨酸。对厚壳贻贝H2A 和H2B 分别采用原鸡(Gallus gallus) H2A 空间结构(RCSB 数据库编号为1eqz.1.C)和黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) H2B 空间结构(RCSB 数据库编号为7pj1.1.B)为模板进行三级结构预测，结果显示，H2A 蛋白三级构象包括5 段α-螺旋以及无规卷曲结构，无β-折叠结构(图2-c)；H2B 的三级构象同样以α-螺旋为主，包括4 段α-螺旋，其余为无规卷曲结构(图2-d)。
(a) 厚壳贻贝H2A 的结构域预测结果，(b) 厚壳贻贝H2B 的结构域预测结果，(c) 厚壳贻贝H2A 三级结构预测结果，(d) 厚壳贻贝H2B 三级结构预测结果。结构域预测采用SMART 软件在线进行，三级结构预测采用SWISS MODEL 服务器进行。白色箭头表示衍生肽所在部位。
2.2 厚壳贻贝H2A 和H2B 在不同微生物刺激下的免疫反应模式
血细胞、鳃和消化腺是贻贝体内代表性的免疫相关组织；同时，已知贻贝免疫体系对不同的微生物具有不同的免疫响应[37]。为此，分别采用金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)、副溶血性弧菌(革兰氏阴性菌)以及白色念球菌(真菌)为诱导菌株，分析了厚壳贻贝H2A 和H2B 基因在3 种微生物刺激下，其在厚壳贻贝血细胞、鳃以及消化腺组织中的相对表达量变化。厚壳贻贝H2A 在消化腺中表现出对金黄色葡萄球菌的快速且敏感的响应特征，其峰值出现时间(4 h)早于副溶血性弧菌诱导(24 h)，且其表达量上升倍数(相对对照组为8 倍)也高于副溶血性弧菌诱导组(4.5 倍) (图3-a)。在鳃组织中，H2A 在金黄色葡萄球菌诱导后，其表达量峰值出现在24 h，上升倍数约10 倍，在副溶血性弧菌和白色念球菌诱导后，其表达量峰值均出现在8 h，上升倍数均约为5 倍。在血细胞组织中，H2A 表现出对白色念球菌诱导的敏感性，其表达量峰值出现在诱导后8 h，且上升倍数相对对照组约为9 倍。H2A 在副溶血性弧菌诱导后，其表达量峰值出现在24 h，上升倍数约为6 倍，但在血细胞中，H2A对金黄色葡萄球菌诱导表现不敏感(图3-a)。
(a) H2A 在消化腺中的表达量变化，(b) H2B 在消化腺中的表达量变化，(c) H2A 在鳃中的表达量变化，(d) H2B 在鳃中的表达量变化，(e) H2A 在血细胞中的表达量变化，(f) H2B 在血细胞中的表达量变化。数据以平均值±标准差(n=3)展示，显著性差异分析基于One-Way ANOVA 算法，采用Tukey 氏检验进行，分析软件为SPSS (v25.0)，*和**分别代表P＜0.05 和P＜0.01 (实验组与对照组之间的变化，n=3)。
H2B 则表现出与H2A 不一样的响应特征。在消化腺中，H2B 对白色念球菌和副溶血性弧菌诱导较为敏感，其表达量峰值分别出现在8 和24 h，相对对照组，其表达量上调倍数分别为3.2 和3.5倍；但对金黄色葡萄球菌诱导表现不敏感(图3-b)。在鳃组织中，H2B 则表现为对金黄色葡萄球菌诱导的敏感性、持续性，其表达量在2～24 h 均相比对照组极显著上调(P＜0.01)，其峰值表达量出现在24 h，表达量上调倍数约为6.5 倍。H2B 对白色念球菌和副溶血性弧菌也表现出一定的敏感性，其表达量峰值均出现在8 h，表达量上调倍数约为3.4 倍。在血细胞中，H2B 则对金黄色葡萄球菌诱导表现不敏感，但是对副溶血性弧菌诱导表现较为敏感，其表达量峰值出现在24 h，表达量上调倍数约为3 倍。此外，H2B 在血细胞中对白色念球菌诱导表现出一定的持续性，其表达量在8～48 h均保持了较高的上调倍数(2.2～2.5 倍) (图3-b)。
2.3 Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ的固相化学合成
采用固相多肽合成技术完成对Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ的化学合成。Coruscusin-Ⅰ合成后的粗品经高效液相色谱纯化，其目标峰出峰时间为13.39 min (图4-a)。根据曲线下面积计算其纯度达到96%以上；质谱鉴定结果表明，合成的Coruscusin-Ⅰ分子量为2 480.08 u，与理论分子量(2 480.87 u)一致(图4-a)。合成的Coruscusin-Ⅱ经高效液相色谱纯化，其纯度达到96 %以上，其质谱鉴定分子量为1 709.02 u，与理论分子量(1 709.11 u)一致(图4-b)。上述结果表明，分别来源于厚壳贻贝H2A 和H2B 的肽段Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ合成成功，可用于后续研究。
箭头所示为目标峰的质谱检测结果。
2.4 Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ的抑菌活性
Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ在100 μmol/L 浓度下，对所测试的微生物均表现出抑菌活性(图5)。其中，Coruscusin-Ⅰ对革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌，以及革兰氏阴性菌中的河流弧菌、铜绿假单胞菌抑制率较强，其抑制率均在60%以上；而对革兰氏阳性菌中的蜡状芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，以及革兰氏阴性菌中的副溶血性弧菌和大肠杆菌的抑制率较弱，均在50%以下(图5-a)。Coruscusin-Ⅱ对革兰氏阳性菌中的巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，革兰氏阴性菌中的河流弧菌和铜绿假单胞菌，以及真菌白色念球菌具有较强抑制率(抑制率在60%以上)，而对其他测试菌株抑制率较低(多为40%以下) (图5-b)。
1.金黄色葡萄球菌，2.巨大芽孢杆菌，3.蜡状芽孢杆菌，4.枯草芽孢杆菌，5.地衣芽孢杆菌，6.河流弧菌，7.副溶血性弧菌，8.大肠杆菌，9.铜绿假单胞菌，10.白色念球菌。
2.5 对Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ的圆二色性光谱分析
采用圆二色性光谱完成对Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ在三种不同溶液(纯水、PBS 缓冲液以及30% TEF)中的结构分析。Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ在不同溶液条件下的圆二色性光谱曲线存在明显差异，表明两种多肽的溶液构象存在差别(图6)。进一步根据文献报道的计算公式[38]计算这两种多肽在3 种溶液条件下的4 种二级结构含量，结果见表2。Coruscusin-Ⅰ在水及PBS中的构象主要以无规卷曲为主，其α-螺旋含量为0；但在30%的TFE 溶液中，其α-螺旋含量增加到41.2%，表明Coruscusin-Ⅰ在非极性条件下，具有形成α-螺旋的倾向。Coruscusin-Ⅱ则在水及PBS 溶液中以无规卷曲为主，含量占比达到78%以上；而在30%的TFE 溶液中，其α-螺旋含量增加到15.2%，β-转角增加至17%，且β-折叠消失，表明在非极性溶液中，Coruscusin-Ⅱ表现出极性条件中与Coruscusin-Ⅰ不一样的构象特征，且存在较大差异。
表2 Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ在不同溶液中的二级结构含量
A.丙氨酸，R.精氨酸，F.苯丙氨酸，S.丝氨酸，H.组氨酸，G.甘氨酸，P.脯氨酸，Q.谷胺酰氨，I.异亮氨酸，L.亮氨酸，V.缬氨酸，K.赖氨酸，T.苏氨酸，M.甲硫氨酸。
3 讨论
组蛋白及其衍生肽历来是生物抗菌肽研究的重要领域，其在脊椎动物，特别是在鱼类免疫中的研究已相当深入[12]。然而，无脊椎动物中的组蛋白及其衍生肽在免疫中的相关作用研究目前尚不多见。贻贝具有丰富的抗菌肽分子多样性，因此赋予了该物种较强的疾病耐受性，也使得贻贝抗菌肽成为新型生物抗生素研发的重要来源 [39-40]。考虑到组蛋白及其HDAPs 在其他物种中的重要免疫相关功能，推测贻贝体内的组蛋白可能也发挥了类似的作用。从以往报道来看，HDAPs 主要来自组蛋白H2A 和H2B[41]，因此，实验首先测试了厚壳贻贝H2A 和H2B 基因在微生物诱导后的表达量变化。通过3 种不同代表性微生物(革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌)对厚壳贻贝进行胁迫，结合qPCR 分析，发现厚壳贻贝H2 组蛋白基因在微生物胁迫后均出现明显上调，表明贻贝组蛋白确实参与了贻贝的免疫响应。但是在不同组织以及不同微生物胁迫下，H2A 和H2B 表达变化表现出不同的免疫响应特征。其中，H2A 在消化腺及鳃组织中表现为对革兰氏阳性菌的敏感性，而在血细胞组织中表现为对真菌的敏感性；H2B 则在消化腺和血细胞组织中表现为对革兰氏阴性菌和真菌的敏感性，但在鳃组织中表现为对革兰氏阳性菌的敏感性。推测该结果与贻贝不同组织对不同微生物有着不同的识别以及免疫信号转导机制有关。考虑到贻贝不同组织在水中的暴露程度不同，面临的微生物威胁也不尽相同，因此，贻贝不同组织的组蛋白H2 表现出对不同微生物的免疫调控机制不同。
组蛋白参与宿主免疫防御的分子机制目前被认为有多种不同的方式，包括组蛋白本身直接参与抗菌功能[19-20,42]，以及通过酶裂解手段，从其序列中产生相应的肽段即HDAPs，来发挥抗菌活性[41]。其中HDAPs 是组蛋白参与免疫的主要方式。根据以往报道，HDAPs 主要裂解自组蛋白的N 端片段，且不同物种裂解自同一组蛋白的HDAPs 在序列上往往具有较强的保守性[43]。尽管不同类型的组蛋白均有可能产生HDAPs，但组蛋白H2A 和H2B目前来看是产生HDAPs 的主要组蛋白来源[41]。通过对厚壳贻贝组蛋白H2A 和H2B 的N 端肽段的化学合成以及抑菌活性研究，发现厚壳贻贝H2A的衍生肽Coruscusin-Ⅰ和H2B 的衍生肽Coruscusin-Ⅱ均表现出明显的体外抑菌活性。从结果来看，Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ对所测试的菌株均表现出强弱不一的抑菌活性，且与其他物种H2A 和 H2B 衍生肽的抑菌活性类似，如hipposin[44]、parasin Ⅰ[45]、buforin I[8]和buforin Ⅱ[46]。
在抑菌活性分析中，Coruscusin-Ⅱ相对于Coruscusin-Ⅰ表现出对真菌较强但对革兰氏阴性菌较弱的抑制活性(图5)，推测与其序列中碱性氨基酸的种类和分布差异有关。精氨酸和赖氨酸被认为在HDAP 的抑菌活性中发挥了关键作用[5,47]，其中精氨酸有利于抗菌肽穿越细菌细胞膜[5]，而赖氨酸则有利于抗菌肽裂解细菌细胞膜[48]。从Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ的序列及螺旋特征来看，二者的主要区别在于Coruscusin-Ⅰ的碱性氨基酸以精氨酸为主，且在螺旋外侧呈均匀分布特征，而Coruscusin-Ⅱ的碱性氨基酸全部为赖氨酸，在其螺旋外侧呈集中分布特征(图7)。因此，推测上述差异可能是Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ抑菌活性存在差异的内在原因。
本实验结果显示，Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ在水溶液以及非极性溶液中，其构象也存在差异。特别是在非极性溶液中，二者的构象均表现为在相对极性溶液(水溶液和PBS)条件下，其螺旋含量明显上升(图6，表2)，这可能有助于Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ在靠近细菌细胞膜后，通过构象变化来破坏或穿越细胞膜从而发挥抑菌活性。此外，Coruscusin-Ⅰ在非极性条件下的螺旋含量(41.2%)明显高于Coruscusin-Ⅱ(15.2%)(表2)，推测与Coruscusin-Ⅱ序列中含有较多的脯氨酸有关。脯氨酸对α-螺旋具有破坏作用，但有利于β-转角的形成，因此，Coruscusin-Ⅱ在非极性条件下表现出较Coruscusin-Ⅰ更多的β-转角(17.0% vs.3.4%，表2)。上述结果也表明，Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ在不同溶液体系中的构象变化以及二者之间构象的差别可能也是这两种多肽抑菌活性差异产生的原因之一。
以上研究首先在厚壳贻贝组蛋白H2 的基因表达层面确认了其在微生物胁迫后的免疫响应，同时也分析了H2A 和H2B 的N 端肽段的抑菌活性及其可能的机制，初步证实厚壳贻贝组蛋白可能参与了其免疫防御过程。上述研究进一步拓展了组蛋白在贻贝免疫防御中的可能分子角色的科学认知，同时，也为后续深入研究贻贝组蛋白来源抗菌肽的分子机制，以及在此基础上开发贻贝组蛋白衍生肽为来源的新型生物抗生素奠定了基础。但是厚壳贻贝完整的组蛋白H2 是否具有抑菌活性，H2 组蛋白衍生肽段(Coruscusin-Ⅰ和Coruscusin-Ⅱ)是否在贻贝体内真实存在，以及厚壳贻贝H2 及其衍生肽在贻贝免疫防御过程中的具体分子过程和机制有待研究。