2021年7月，百迈客和浙江大学附属妇产医院合作文章“Lack of MECP2 gene transcription on the duplicated alleles of two related asymptomatic females with Xq28 duplications and opposite X‐chromosome inactivation skewing”发表于期刊Human Mutation（IF：4.878）。其中转录组数据差异及功能分析、外显子测序分析等由百迈客完成，此外百迈客业务还包括单细胞转录组、空间转录组、单细胞ATAC&GEX、单细胞免疫组库等，有兴趣的老师可以联系当地销售。
Xq28重复综合征（MDS）是一种严重的神经发育障碍。症状和体征包括婴儿张力过低、精神运动发育迟缓、严重智力残疾、言语发育不良、进行性痉挛、反复呼吸道感染和男性癫痫发作。MDS是由甲基CpG结合蛋白2基因（MECP2）的重复（或三倍）引起的，其增加转录调节因子MeCP2的表达。如小鼠模型和人类所示，MeCP2蛋白过度表达可能对大脑发育和功能产生有害影响。最初，MDS被认为只在男性中出现，而大多数重复的女性是无症状携带者。然而，后来的报告显示，20多名MECP2重复的受影响女性存在轻度至严重的临床表型。
X染色体失活（XCI）是X染色体的一种转录沉默机制，由XIST的转录启动。XCI通过募集染色质重塑酶复合物诱导渐进表观沉默。一条X染色体在女性个体中随机失活，但一些女性表现出两条X染色体之一的倾斜失活（shewed XCI）。倾斜的XCI可导致女性X连锁疾病的表型异质性。MECP2是一个受XCI影响的基因，而XCI似乎对Xq28重复女性中的MECP2表达至关重要。
本文中作者检测了两例无症状女性（母亲和祖母）间质性Xq28重复。AR（androgen receptor）和RP2（retinitis pigmentosa 2）分析表明，两者的XCI都极为倾斜，Xq28重复染色体在母亲体内失活，但在祖母体内被意外激活。有趣的是，通过结合RNA测序和全外显子组测序，作者证实XIST仅在两名女性的Xq28重复染色体中表达，表明Xq28重复染色体不活跃。同时，排除这两名女性，尤其是祖母的主要临床表型，重复X染色体中的MECP2和大多数XCI基因没有转录表达或上调。作者发现，使用RNA测序检测的XCI状态与建立女性MECP2复制的临床表型更相关。这表明，除了DNA甲基化之外，还有其他因素维持XCI状态，一种可能的额外抑制机制发生在非甲基化X染色体的转录水平，抵消了MECP2复制的有害表型效应。
英文题目：Lack of MECP2 gene transcription on the duplicated alleles of two related asymptomatic females with Xq28 duplications and opposite X‐chromosome inactivation skewing.
中文题目：转录组+外显子揭示Xq28重复综合征女性患者无临床症状的原因
期刊：Human Mutation
IF：4.878
作者：Yixi Sun
材料：具有典型的MECP2重复综合征症状男孩患者（III.2）、其母亲（II.2）、父亲（II.1）、外祖母（I.2）、外祖父（I.1）；Keywords：RNA-seq；WEX；SNP微阵列；
一、通过SNP阵列、qRT-PCR和FISH分析，在女性II.2和I.2中发现Xq28染色体内重复
使用SNP微阵列检测I.1、I.2和II.2的变化。在II.2和I.2（图1b）中，在Xq28区域和Xq27.3区域分别显示了437KB的重复和284KB的重复，这表明Xq28和Xq27.3重复是母系遗传的。Xq28区域包含13个在线孟德尔人遗传（OMIM）基因（包括MECP2、IRAK1、L1CAM、NAA10和HCFC1）。通过qRT-PCR以验证结果，在男性I.1中检测到MECP2和IRAK1一个基因剂量的拷贝，而在正常对照女性中检测到两个拷贝，在I.2和II.2中检测到三个拷贝（图1c，d）。对女性I.2和II.2的中期染色体进行FISH分析，发现含有MECP2的探针RP11-119A22仅在Xq28处有信号，这表明Xq28重复是串联的，没有整合到基因组的其他地方（图1e，f）。
二、AR和RP2分析表明，女性I.2和II.2具有极度倾斜的XCI
作者进行了基于PCR的AR和RP2分析，以评估外周血中的XCI模式。使用甲基化敏感的限制性内切酶HpaII，使PCR只扩增非活性X染色体上的等位基因。通过分离分析确定了失活X染色体的起源。
II.2的未消化PCR产物给出了每个标记的两个峰（AR为267/287，RP2为359/381）。HPAII消化产物（图2c和2f）观察到一个代表287个AR（359个RP2）的主峰，这表明失活等位基因遗传自I.2。对I.2的未消化PCR产物的分析给出了两个峰（AR为281/287，RP2为359/374）。通过分析HpaII消化产物（图2b和2e）检测到的主峰（AR为281，RP2为374）与II.2失活产物等位基因中的主峰不同。这些结果表明，在母亲II.2和祖母I.2中发现了XCI的极端倾斜，这与失活X染色体不同（图2）。AR PCR产物的287 bp峰值、II.2中RP2 PCR产物的359 bp峰值以及Xq28重复来自祖母I.2，它们与相同的X染色体相连。然而，该等位基因在AR PCR后峰值为287 bp，RP2 PCR后峰值为359 bp，Xq28重复，在II.2中失活，但在I.2中激活。
三、使用外显子组测序在I.2中未检测到X染色体上没有Xq28重复的其他潜在致病性变体
根据AR和RP2分析的结果，I.2中的MECP2重复应该位于活跃的X染色体上。如果两条X染色体都有缺陷，则具有更有害变体的突变X染色体将完全失活，以避免其不良反应，迫使另一条变得活跃。因此，对于I.2，假设在没有Xq28重复的X染色体上存在额外的更有害的致病性变体，从而迫使Xq28重复变得活跃。
微阵列结果中显示，除了Xq28和Xq27.3重复外，在I.2和II.2中未发现致病性拷贝数变异。为了进一步探索其他变体，作者对女性I.2和II.2的DNA进行外显子组测序，在I.2和II.2中筛选了X染色体上OMIM基因的不同变体，特别是在I.2中没有Xq28重复的X染色体上的变异。结果显示，X染色体上有12个变异，包括一个无义变体和11个错义变体。只有三个基因（NR0B1、DMD和USP9X）与疾病有关，根据ACMG指南，所有变异均不符合“致病性”或“可能致病性”的分类（Richards等人，2015）。没有证据表明这些变体比Xq28复制品更有害。总之，在I.2中未发现可导致继发性倾斜的其他潜在致病性变体。
四、对于II.2和I.2，XIST中的杂合SNP 仅在具有Xq28重复的X染色体中表达，这表明Xq28重复染色体不活跃
为了确定可能导致I.2原发性倾斜的原因，作者对外周血单个核细胞（PMBC）进行了RNA测序；通过外显子组测序，作者在I.2和II.2的XIST区域附近鉴定了8个SNP。对于I.2和II.2，没有发现XIST的所有SNPs存在差异，也没有证据表明这些变体会影响XCI的初始过程。在I.2中，没有Xq28重复的X染色体上没有假定的主要倾斜原因。
五、RNA测序显示两名女性的Xq28重复等位基因上的MECP2和IRAK1没有转录表达
X连锁基因的XCI状态被定义为逃逸、可变逃逸和失活。XCI基因，如MECP2和IRAK1，仅在活跃的X染色体上表达。II.2和I.2中XCI基因（MECP2、IRAK1、TMEM187和TKTL1）的所有SNP表达均处于纯合状态，表明II.2和I.2中的XCI极为倾斜。在Xq28重复区域中，有几个信息可以确定亲本来源的单核苷酸多态性，如MECP2（NC_000023.11:g.154030040）、IRAK1（NC_000023.11:g.154013378等。结果表明，从祖母I.2遗传的等位基因（具有Xq28重复）没有转录表达。同样，在可变的XCI基因HCFC1、NAA10和逃逸的XCI基因RENBP中，母亲从I.2遗传的重复等位基因表达较低。图4 中显示的XCI基因的信息性SNP，发现XCI基因MECP2和IRAK1在Xq28II.2和I.2的重复等位基因在转录中沉默。
通过PMBCs中的RNA-seq，作者比较了两名MECP2重复的女性和两名年龄匹配的对照女性之间的差异表达。然后重点研究了跨基因的基因转录Xq28——II.2和I.2中的重复区域；MECP2和IRAK1基因的表达剂量在II.2和I.2之间无显著差异。另外，还通过RT-qPCR检测了具有Xq28重复的家族成员和年龄匹配的正常人中MECP2和IRAK1的mRNA（图5）。与年龄匹配的男性对照组相比，III.1中MECP2和IRAK1的表达剂量显著升高（平均分别为4.6倍和5.2倍），而与年龄匹配的女性对照组相比，Xq28复制女性I.1和II.1中的剂量没有显著上调。
作者通过对Xq28重复（涉及MECP2）女性（母亲和祖母）进行转录组和全外显子测序。仅从AR和RP2分析判断，I.2应该有相关的临床表型，并且MECP2基因表达上调，但I.2是无症状携带者。作为59岁的女性，I.2可能发生与年龄相关的XCI倾斜。通过AR分析，在55-60岁以上人群的横断面研究中，XCI的倾斜度随着年龄的增长而显著增加，但有趣的是，Swierczek等人通过一种新的XCI分析转录分析，发现老年女性的倾斜度没有增加。甲基化水平和转录水平检测到的XCI状态不一致。
作者的结果相似，通过结合RNA-seq和RT-PCR，发现在非活性X染色体上特异表达的X-非活性特异转录物XIST仅在I.2和II.2的Xq28重复染色体上表达。这表明Xq28重复染色体是不活跃的。另外还发现，两个女性的Xq28重复等位基因上的MECP2和IRAK1（受XCI影响的基因）没有转录表达。这解释了为什么这两名女性，特别是I.2，是无症状携带者。同时，作者推测，除了DNA甲基化之外，其他因素也在维持XCI状态，一种额外的抑制机制可能发生在非甲基化X染色体的转录水平，以抵消MECP2复制的有害表型效应。根据XCI，作者的发现为MECP2重复综合征知识及其在女性中的表型后果增加了新的见解，这对遗传和产前咨询具有重要意义。
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