11月21日，2021年淋巴组织增生性病变病理新进展会议圆满落幕，专家们的讲座精彩纷呈，涵盖了淋巴瘤诊断的各个方面，高峰时段在线听课人数高达八千多人。在卫星会环节，安必平基因诊断事业部总监陈绍宇博士就日常工作中高级别B细胞淋巴瘤FISH探针使用时碰到的使用陷阱及不典型信号判读做了分享。
FISH与淋巴瘤诊断
荧光原位杂交技术（FISH）是利用荧光素标记的核酸探针，与组织中的目标靶序列进行杂交，从而反映基因或染色体的状态信息。FISH技术具有独特的形态与分子相结合特点，可检测绝大部分与肿瘤诊疗相关的基因或染色体大片段异常（扩增、缺失、断裂与融合），在肿瘤病理诊断中简单实用。
淋巴瘤病理亚型众多、诊断及鉴别诊断非常复杂，需要综合临床表现、病理形态学、免疫表型及分子遗传学来判断。其中，分子检测是淋巴瘤病理诊断思路中很重要的一环，为淋巴瘤患者的诊断及鉴别诊断、分子分型、治疗及预后判断提供了重要的辅助手段。而高级别B细胞淋巴瘤组织学分级高、分子分型对临床决策影响重大，指南推荐多种FISH靶点检测。陈博士从以下方面进行了分享：
探针的阈值
淋巴瘤相关探针大多都为断裂（易位）探针。断裂探针的阳性信号标准一般来讲红绿信号间距1-2个信号点直径及以上即可判断为阳性信号，但这并不是唯一且绝对的标准，实际上要综合多方面的因素：
内部因素：探针设计的红绿区段的长度和间距，以及探针所在区段的基因组特异性（如IGH基因在基因组中有非特异同源片段；
外部因素：镜下整体阅片的感觉（细胞核大小、信号强度、信号是否拉丝），样本经处理后的染色质松散程度以及采图摄像头的放大倍数。
这里需牢记一点：阳性细胞大多不是零散出现，而是成片出现。当大量正常信号间距背景细胞中，出现个别间距较大的细胞，更应理解为为此细胞的染色质比较松散而导致间距偏大（如下图）。
严格来说，阈值需要实验室自行建立，常用方法为20例同类型阴性样本，阳性信号的平均值 3倍标准差。若无法自建阈值，断裂探针可采用通用阈值10%-15%。注意这是基于一些前提条件：（1）不同断裂探针的设计（如红绿间距、长短）比较接近，大多为几百kb；（2）不同断裂探针的信号强度也比较接近，受样本处理的影响较小。当然，碰到临近阈值时，需结合样本信息（如大体/穿刺样本、选择的肿瘤细胞计数区域）及扩大计数来判断。
以MYC断裂探针为例，MD Aderson专门进行了分析，可见除1R1G1F之外的比例更高的多种其他信号，其中1F/3F/4F为高频多见，nRnGnF少见。在伴有多种不同细胞克隆的样本中，信号类型表现也更为复杂，比如弥漫大B的信号复杂度就明显高于伯基特淋巴瘤。并且，FISH探针信号反映的是其基因所在区段或染色体的异常，信号类型越复杂，则其核型越复杂，并且与预后差相关。
MYC断裂探针使用陷阱
我国从2018年开始，CSCO指南就明确指出，对初发和治疗后复发的DLBCL均推荐FISH方法检测MYC、BCL2、BCL6重排，且明确定义了“双打击”及“三打击”淋巴瘤。
其中，MYC断裂探针使用最为广泛及重要。日常工作中，需要考虑到伯基特淋巴瘤和弥漫大B的遗传学差异。在伯基特淋巴瘤中，MYC断裂位点主要有三种类型，位于红色或绿色探针处则会表现为一红一绿一黄典型阳性之外的其他不典型阳性信号。MYC探针断裂位点的复杂性在不同肿瘤中可表现不同，如在DLBCL中较为多样，而在BL中则为单一；在DLBCL中更容易表现为复杂阳性信号，反映出不同起源细胞克隆的复杂程度，并且与预后相关。
实际工作中，MYC断裂探针及MYC-IGH融合探针，二者该如何选择？这里需注意两方面：
（1）断裂与融合探针的覆盖范围，同一探针不同厂家的位置及颜色设计差异。如BL中有三种断裂点，DLBCL中的断裂跨度主要为800kb。融合探针中MYC的覆盖范围小于MYC断裂探针的。
（2）MYC-IGH融合在双打击淋巴瘤中预后最差，一篇大宗数据1100多例弥漫大B数据显示，双打击或双表达伴MYC-IGH融合占比5%，预后最差，故该融合探针可作为MYC断裂阳性后进一步做预后判断的指标。且在免疫母细胞型DLBCL和浆母细胞淋巴瘤中的MYC-IGH阳性率高，这两种肿瘤的组织学分级及预后也相对较差。
双/三打击断裂探针的使用陷阱
双/三打击淋巴瘤中MYC、BCL2及BCL6三个断裂探针的伙伴基因较多，除了IGH外，还可涉及到IGK，IGL以及其他基因。其中MYC基因的伙伴基因众多，除了主要为IGH外（占比50%多），还可有IGK、IGL、BCL6，ZCCHC7，IGL，RFTN1，CD96，SOCS1等，且部分双/三打击患者是由于MYC与BCL6相互易位所致。
在DLBCL中，BCL2基因断裂位点主要发生于外显子2的下游50kb处，绝大部分与IGH融合（65/67）；BCL6断裂位点则位于外显子1/2之间，主要与MYC（9/15）或IGH（4/15）融合。
不只是IGH，我司也已开发了IGK和IGL探针，感兴趣的老师可进一步用于科研。
有意思的是，白种人双打击数据中，MYC与BCL2 的融合比例高于与BCL6的，如下图的59%vs20%。但是，我们台湾2021年的282例DLBCL数据显示，MYC易位阳性占比16.7%，进一步分析其中的双打击/三打击患者，MYC与BCL6融合的占比高达50%，且高于BCL2(33%)，此数据恰好与白种人的反过来。实际工作中，我们了解到的BCL6易位阳性率也是显著高于BCL2的。是否由于人种不同所致，还需进一步扩大数据分析。MYC重排的双/三打击淋巴瘤中，MYC与BCL6同时阳性的阳性率要比MYC与BCL2以及三打击要高，可作为双/三打击探针选择的因素之一。
日常应用中，双/三打击断裂探针阳性的比例相当较低，且可碰到更高比例的数目增加异常，如三拷贝或更多。如果断裂探针为阴性、但呈多体表现，需注意其与预后相关，报告中需备注出多体类型及其比例。
并没有合适的临床表型或组织学形态特征可用于清晰预测哪些为双/三打击高级别B细胞淋巴瘤，且不会造成一部分遗漏。其分子特征和MYC/BCL2蛋白表达被认为是更为客观的筛选出HGBL-DH/TH的手段。考虑到患者费用，可先做MYC断裂，其阳性后再进一步行BCL2及BCL6检测；但是这样可能会延后出报告时间及临床治疗决策。
上图：MYC和BCL2易位及免疫表达与GCB和ABC分型的关系。三个靶标IHC表达阳性更多见于ABC细胞起源亚型，但其基因易位阳性更多见于GCB亚型。
其他基因断裂探针判读陷阱
复杂易位会导致出现1红1绿1黄之外的其他非典型阳性信号，报告阳性，但需在备注中备注其信号类型及比例。以IRF4断裂探针为例。IRF4易位相关的淋巴瘤可见于皮肤间变大、儿童型滤泡性淋巴瘤、伴有IRF4/MUM1重排的大B细胞淋巴瘤（形态学类似与FL3B或DLBCL）。目前已有数据显示，IRF4断裂位点存在多个，如CD30阳性皮肤T细胞淋巴瘤亚型-IRF4断裂可有多种不典型阳性信号。下图为我司与北京友谊医院的合作病例，断裂位点发生偏倚而在绿色探针区域断开，产生2黄1绿的阳性信号。
并且，处于端粒端的基因更倾向于发生复杂的不典型阳性易位，如MYC基因（8q24）及BCL6基因（3q27）。下图为我司检验所碰到的两例BLC6不典型阳性。
左：BCL6断裂，1绿1黄 右：BCL6断裂，1红2黄
在软组织肿瘤中，也同样会发生不典型阳性易位。如下图为文献报道的滑膜肉瘤SYT断裂探针不同信号类型。总而言之，FISH信号类型越复杂，其基因组复杂程度越高，需报告主要异常类型及比例。
淋巴瘤数目探针判读陷阱
2016版WHO分类，新增一种建议实体（provisional entity）淋巴瘤亚型--伴有11q异常的伯基特淋巴瘤。最早是用比较基因组杂交方法发现的，作者在59例伯基特淋巴瘤中发现了两例存在11q异常，表现为11q23.3数目增加及11q24.3数目缺失。我司也设计了11q23.3/11q24.3数目异常探针，分别以11号着丝粒探针为内参；获得和缺失的阈值可参考20%-30%通用阈值范围（先排除杂交效率偏低而导致信号丢失）。只伴有一种异常的患者该如何诊断？从文献来看，这种异常也是可能存在的，特别是末端发生缺失，综合组织学及免疫表型，建议倾向于诊断为阳性。
需要注意，11q获得/缺失异常和缺乏MYC易位等特征更多见于移植后的BL病例。并且，目前已发现，11q获得/缺失异常不只是存在于MYC阴性的伯基特样淋巴瘤中，也可见于一些MYC阳性的BL中和MYC阳性的HGBL，NOS中。
淋巴瘤中PD-L1/L2扩增探针为最近文献所关注，在结节硬化型霍奇金淋巴瘤及弥漫大B中都有多篇报道，可表现为多倍体、获得和扩增三种异常类型。两篇研究显示：（1）弥漫大B中PD-L1/L2扩增占27%，非GCB常见，伴局限性T细胞浸润；（2）在DLBCL中，PD-L1/L2扩增为独特分子异常，类似原发纵隔大B细胞淋巴瘤。而两个基因位置挨得很近，探针可通用，同理还有DUSP22/IRF4重排。
FISH探针用于病理科研
（1）2019年北京宣武医院--RELA探针，使用46例样本，结果数据发表在美国外科病理学杂志（AJSP）。
（2）2021年，北京宣武医院使用RELA探针，应用于成人颅内室管膜瘤，再一次发表在AJSP。
（3）2019年AJSP首次报道PRDM10靶标用于CD34阳性的浅表性纤维母细胞肿瘤诊断后，我司与浙江省人民医院赵明老师迅速合作开发，发表在Pathology上。
（4）由于孤立性纤维性肿瘤NAB2基因与STAT6基因挨得非常近，无法使用FISH检测，2020年，我司基因诊断整合多平台验证，协助浙江省人民医院用RT-PCR方法验证NAB2-STAT6基因融合，发表在第十届全国骨和软组织病理年会上
（5）2021年，我司用FISH探针及RT-PCR测序，协助北京积水潭医院联合检测验证尤文样肉瘤BCOR易位。
（6）2021年，我司与浙江省人民医院赵明老师合作病例报道，诊断了一例：脂肪纤维瘤样神经肿瘤形态为主、IHC共表达CD34、S100及神经束膜分化标志物的伴有BRAF基因易位的梭形细胞间叶肿瘤，为全球第二例。
结语
陈博士此次的分享，从FISH探针使用及判读的实践角度出发，结合临床意义及文献，给大家带来实用的知识要点。学习病理，专注病理，我们与各位病理老师一同学习、共同进步。