梅花是中国传统的观赏植物，以其花朵芳香而闻名，主要由花瓣散发出来。然而，梅花花瓣的细胞类型和挥发性合成的研究很少报道。近日，西北农林科技大学于 Horticulture Research期刊发表了题为“Single-cell RNA sequencing reveals a high-resolution cell atlas of petals in Prunus mume at different f lowering development stages”的研究论文，该研究利用单细胞RNA测序技术，研究了梅花在花蕾期（BS）和盛花期（FS）花瓣中的基因表达。花瓣中鉴定到6种主要的细胞类型：表皮细胞（ECs）、薄壁细胞（PCs）、木质部薄壁细胞、韧皮部薄壁细胞、木质部导管和纤维，以及筛子元素和伴生细胞复合体，并筛选出每种细胞类型中的细胞特异性标记基因，最后测定了梅花花瓣在4个开花发育阶段的香气物质，为花挥发物合成的分子机制提供了新见解。
1.梅花花瓣scRNA-seq，鉴定六种主要细胞类型：表皮细胞、薄壁细胞、木质部薄壁细胞、韧皮薄壁细胞、木质部导管和纤维、筛分子和伴胞复合体；
2.确定每种细胞类型中表达量前5的基因为细胞特异性标记基因；
1.梅花花瓣的单细胞转录组测序
使用10X Genomics Chromium平台对梅花品种“FHZS”的花瓣进行ScRNA-seq测序（图1A）。在BS和FS的花瓣中，共分别成功捕获了7983个和8965个高质量细胞，通过BS和FS花瓣的scRNA-seq共鉴定出19072和18296个基因，每个细胞中位基因有3358和2646个。每个细胞的计数（UMI）分别为11973个和9390个。UMAP分析图可以观察到来自花瓣两个发育阶段的细胞（图1B）。同时取4个花发育阶段进行花瓣的bulk-RNA测序。采用Pearson相关分析来比较scRNA-seq和bulk-RNAseq谱之间的基因表达。结果表明，BS和FS花瓣的测序数据有强相关性。（R=0.736和0.721；P < 2.2e-16；图1C)。
图1 梅花花瓣中单细胞转录组的分离与分析
2.梅花花瓣细胞类型的鉴定
在过滤掉低质量的细胞后，对16948个细胞进行了无监督的聚类分析。形成了11个簇（图2A)。由于花瓣中没有细胞特异性标记基因和高分辨率图谱，因此根据其他植物中单细胞标记的同源性进行了分类。簇0为表皮细胞（ECs），其中包含标记基因GPAT6和LTPG1，这些基因参与花瓣形成过程中表皮成分的输出和角质蛋白的生物合成。簇1和簇2是高表达CAP10A和CAB40（FvLHCB2.1同源）的薄壁细胞（PCs），它们是PCs的标记基因。簇3和簇5为木质部薄壁细胞（XPCs），表达标记基因NPF2.11和ABR1。簇4是韧皮部薄壁细胞（PPCs），因为bZIP9在PPCs中特异性表达，推测簇6可能是PPCs，因为其与簇4的相同基因富集。簇8是具有标记基因WAT1的木质部导管和纤维（XVFs），WAT1决定了木材纤维的次生细胞壁厚度，并与拟南芥中XVFs的发育有关。簇10是韧皮部的筛元件伴生细胞复合物（SECC），包含标记基因PP2-A1和PP2-A4。簇6、簇7和簇9的细胞类型不能用当前的标记基因来确定，并被命名为未知细胞（图2B）。
富集分析显示，簇0中的DEGs富含脂质代谢过程和脂肪酸生物合成过程，与ECs有关。簇1和簇2中的DEGs在核糖体生物发生和有机氮化合物代谢过程中富集。簇3~5、8和10被认为是微管组织，这些簇中的DEGs主要参与信号分子的传导和转运。簇6、7和9中的DEGs无法进行进一步分析；根据GO注释结果，ECs中富集途径（簇0）的富集途径主要参与代谢途径、脂肪酸代谢、类固醇生物合成、氨基糖和核苷酸糖代谢等。PCs（簇1和簇2）主要与花瓣的光合作用天线蛋白有关。维管组织（簇3-5、8和10）中的DEGs主要富集于核糖体、次级代谢生物合成、内吞作用和植物激素信号转导途径中。
图2 梅花花瓣中单细胞转录组的细胞簇鉴定
3.梅花花瓣中细胞特异性标记基因的鉴定
在鉴定细胞簇后，相关上调DEGs的数量从簇10的447个到簇0的1834个，每个聚类中排名前5位的基因作为聚类特异性基因（图3）。MALD3、MLP423、FDH、EXL3和CER2在ECs中高度富集（簇0）。UGT94E5、JGB、EIX2、CAB21和AMT1-2在PCs中高表达（簇1和簇2）。MLP328、GAF1、AOMI、PUB21和WRKY18在XPCs中的表达表现出较高的特异性（簇3和簇5）。ABCC14、INVA、RAV2、AVT6A和PLAT1在PPCs中表达更多（簇4）。VIT1、UGT74G1、PME2.1、SAUR32和CHIT5A主要在簇8中表达，并被认为是XVFs中的标记基因。MYR2、CLE25、GRXS1、RL6和PHO1-H1多在簇10中表达，这些基因被认为是SECC中的标记基因。这些标记基因将有助于识别梅花细胞的花瓣细胞类型。
图3 花瓣11个簇中细胞特异性标记基因的表达热图
采用GC-MS技术对“FHZS”花瓣的挥发性物质进行检测分析。检测了BP生物合成产生的苯醇、乙酸苄酯、丁香酚、肉桂醛和苯甲醛。从BS在释放过程中含量增加到FS，在WS时下降，在FS时达到峰值。其中苯甲醛和肉桂醛在四个阶段的含量较低（图4A)。
利用花瓣的bulk-RNA测序数据筛选了58个参与BP通路的DEGs：2个PmPALs，1个PmC4H，1个PmCNL，6个Pm4CLs，10个PmCADs，12个PmCCRs，24个PmBAHDs，2个PmEGSs（图4B）。总体而言，28个结构基因的表达模式从BS增加到FS，与植物气味的释放一致，表明它们可能在植物挥发性合成中发挥重要作用。
梅花的芳香成分以乙酸苄酯和丁香酚为主。PmBAHD5（PmBEAT36的同源物）催化苯甲醇生成乙酸苄酯，PmBAHD3（PmCFAT1的同源基因）参与丁香酚合成，该研究通过在大肠杆菌中的异源表达，深入研究PmBAHD3的功能作用，获得了纯化的重组蛋白，并以苯甲醇为底物进行体外酶活性。采用GC-MS检测反应生产中的乙酸苄酯（图4C）。结果显示PmBAHD3可能对乙酸苄酯的合成起作用，这表明真菌中乙酸苄酯的形成可能是多种醇酰基转移酶组合的结果。
作者分析了“FHZS”花瓣在不同的发育阶段的细胞百分比。从BS到FS，ECs的比例急剧下降，而PCs的比例明显增加。BS和FS之间的微管组织细胞百分比略有变化。根据获得的BS和FS中“FHZS”花瓣各细胞类型中DEGs的表达量，结果表明与BS组相比，FS组有2169个基因上调，3132个基因下调。
为了进一步了解与芳香合成相关的细胞类型，该研究探讨了上述28个候选基因在scRNA-seq的数据中的表达模式：2个PmPAL、1个PmC4H、1个PmCNL、3个Pm4CL、5个PmCCRs、4个PmCAD、10个PmBAHD和2个PmEGSs。其中除Pm4CL4外，共检测到27个基因。在BS和FS中，10个基因（Pm4CL3、PmCCR4、PmCAD4、PmBAHD8、10、12、14、17、24和PmEGS2）在BS和FS中的表达均较低。在所有的细胞中，13个基因PmPAL1、2、PmC4H、PmCNL、PmCCR1、2、3、5、PmBAHD2、5、PmEGS1在FS中的表达均高于BS。虽然这些基因几乎在所有的细胞类型中都有表达，但它们的表达在不同的细胞类型中有所不同，例如，在FS时，ECs和PCs中PmPAL1、2、PmC4H、PmCNL和PmCCR5的表达水平均高于其他类型的细胞。在BS和FS组中，PmCCR1和PmCCR2的表达水平略高，而在SECC组中，PmCCR3的表达水平略高。PmCAD1和PmCAD3在XPCs和XVFs中的表达较高。PmBAHD2主要在ECs和PPCs中表达，从BS到FS明显增加。尽管从BS到FS，PmBAHD5的表达量显著增加，但其在PCs和XPCs中的表达量高于其他类型的细胞。在FS时，PCs中PmEGS1的表达略高。此外，在FS组的所有细胞中，PmCAD2和PmBAHD3、6的表达水平均低于BS组。PmCAD2在FS时的ECs、XPCs、PPCs、PPCs和XVFs中的表达略高。在FS时，除SECC外，PmBAHD3在其他细胞中均有表达，在XPCs、PPCs和XVFs中均有较高表达。在这BS到FS发育阶段，Pm4CL1的表达无显著差异，但其在ECs中的表达显著增加（图5A）。
此外，通过原位杂交证实了PmPAL2、PmCAD1、PmEGS1、PmBAHD3、PmBAHD5等多个基因的主要表达位点，表明scRNA-seq数据是可靠的。PmCAD1和PmEGS1在各细胞类型的花瓣中均有表达，虽然在大多数细胞中均检测到PmBAHD3和PmBAHD5，但PmBAHD3在PPCs和XVFs中的表达高于其他细胞，且PmBAHD5在XPCs中高表达，这与scRNA-seq数据一致。这些结果表明，香气挥发物可能在ECs、PCs和大部分维管组织细胞中合成（图5B）。
该研究利用scRNA-seq构建了第一个木本植物花瓣的单细胞基因表达图谱，并鉴定了梅花花瓣中各细胞类型的标记基因。此外研究结果表明，低挥发性合成可能发生在花瓣中的ECs、PCs和大多数维管组织细胞中。这些发现为进一步探索木本植物花瓣的细胞类型和了解挥发性物质合成的潜在分子机制提供参考。