Systematic evaluation of colorectal cancer organoid system by single-cell RNA-Seq analysis
通过单细胞RNA-Seq分析对结直肠癌类器官系统进行系统性评估
一、摘要
从结直肠癌患者中建立源自患者的类器官，并对来自7名患者的成对样本进行单细胞RNA-Seq，以获取类器官及其相应的体内肿瘤和正常组织。发现源自肿瘤组织的类器官忠实地概括了体内癌细胞的主要基因表达特征。另一方面，来自正常组织的类器官在整个转录组水平上表现出一些肿瘤样特征，但在两种培养基中都保留了正常的基因组特征，例如 CNV、点突变和正常的全局DNA甲基化水平。这些表明条件培养基在肿瘤上皮细胞的长期培养中优于化学成分确定的培养基。最后，相互交换了有机体的培养基，发现互换培养基后，有机体细胞基本保持了原来培养基的转录组特征。
二、结果
结直肠癌类器官的建立和组织病理学表征
建立一组来源于多种类型的CRC患者的手术切除标本的类器官培养物。其中包括7名CRC患者的7个肿瘤类器官培养物和7对相邻的正常类器官培养物，并对其进行了高精度的scRNA-Seq分析（图1A)。其中4名患者的肿瘤和正常来源的类器官在化学成分确定的培养基和条件培养基中培养（图1A）。与之前的研究一致，作者观察到来自肿瘤组织的类器官比邻近的正常来源的类器官呈现出更多样化的形态（图1B）。如图1B所示，肿瘤类器官的形态从薄壁囊性到致密结构不等。然后，对这些培养的类器官进行了几种上皮细胞的免疫荧光染色，结果表明，培养的类器官如预期的那样表达了众所周知的肠上皮细胞标志物（图1C）。
结直肠癌类器官的细胞类型组成
基于细胞的全局基因表达模式，将细胞分成三个簇，它们被注释为上皮细胞、免疫细胞和间充质细胞（图1D-F）。发现体内邻近的正常组织和正常组织衍生的类器官主要由上皮细胞组成。免疫细胞在体内的肿瘤组织中高度富集，但如预期的那样在肿瘤衍生的类器官中几乎没有检测到（图1G）。值得注意的是，化学成分确定的培养基也可能促进间充质细胞的体外生长，因为它们占化学成分确定的培养基中培养细胞的13.5%（图1E-G）。此外，进一步分析上皮亚型，共确定了7 种亚型。在整体范围内，发现与正常组织或源自正常组织的类器官相比，肿瘤组织或源自肿瘤的类器官具有更多百分比的干细胞样细胞。此外，体外培养增加了正常来源的类器官中干细胞样细胞的比例。它表明类器官主要由上皮细胞组成，这意味着体外培养倾向于富集上皮细胞。
相邻的正常组织衍生的类器官在整个转录组水平上表现出一些肿瘤样特征
接下来，研究源自患者的类器官是否可以再现体内肿瘤和邻近正常组织的转录组特征。作者提取了体内肿瘤和正常组织之间的差异表达基因 (DEG)，并分析了它们在体外培养的类器官中的表达模式。结果表明，体内正常上皮细胞和体外正常组织来源的类器官上皮细胞均高度表达了几种众所周知的肠道标志物基因（如 CLCA1、PYY、GCG、CA1、CLDN8 和 SI），这反映了正常组织衍生的类器官保持了体内肠组织的特征性转录特征和细胞类型异质性（图2A）。正如预期的那样，肿瘤衍生的类器官在体内高度表达肿瘤特异性基因，其中许多已被广泛报道与结直肠癌的进展和转移密切相关，例如 PROCR、SCD、BMP4、CEACAM6、TESC 和 TGFBI（图2A )。然而，正常组织衍生的类器官也高度表达了这些体内肿瘤特异性基因的一部分（图2A）。此外，对体内组织切片和培养中的类器官进行了肿瘤特异性基因CEACAM6的免疫荧光染色（图 2B，C）。结果显示CEACAM6在体内仅由肿瘤细胞而非邻近的正常组织高度表达（图2B）。然而，培养中的肿瘤和正常组织来源的类器官均高度表达CEACAM6，证实正常组织来源的类器官获得了结直肠癌细胞的一些基因表达特征（图2C）。为了探究基因调控网络是否也表现出类似的模式，因此在体内和体外样本中探索了肿瘤特异性基因调控网络。结果表明，与体内正常上皮细胞相比，正常组织和肿瘤来源的类器官均显示出体内癌细胞特异性基因调控网络（图 3A）。总之，这些数据表明，在RNA、蛋白质和基因调控网络水平，正常组织衍生的类器官在体外培养后获得了一些肿瘤样特征。
不同培养基之间的转录组特征比较
如图1F所示，化学成分确定的培养基和条件培养基的细胞类型组成不同。因此，进一步探讨了这两种培养基之间基因表达的差异。发现Wnt信号靶基因AXIN2在条件培养基中培养的细胞中高表达（图3B）。此外，另一个Wnt信号靶基因WNT6主要由在条件培养基中培养的正常组织来源的类器官表达（图3B）。接下来，比较了不同培养基和体内组织中上皮细胞的干/祖细胞标记基因 (OLFM4) 和分化标志基因 (CA2) 的表达（图3C）。结果表明，在条件培养基中培养的类器官细胞与体内相应的上皮细胞保持了CA2和OLFM4的差异表达模式。在化学成分确定的培养基中，肿瘤组织来源和正常组织来源的类器官细胞混合在一起，CA2和OLFM4的表达没有显着差异，表明化学成分确定的培养基有利于正常上皮细胞的干细胞样特征，而不利于它们的分化/成熟特征（图3C）。接下来，通过MKI67的表达测量了不同培养基中的细胞增殖。在化学成分确定的培养基中，正常组织衍生的类器官比肿瘤衍生的类器官具有更快的细胞增殖。另一方面，在条件培养基中，正常组织和肿瘤组织衍生的类器官显示出相当的增殖率（图3D）。这表明化学成分确定的培养基有利于正常上皮细胞的生长，而条件培养基一般对正常上皮细胞和癌症上皮细胞的生长没有偏倚。
线粒体突变的谱系追踪
使用线粒体突变，可以准确区分体外培养的类器官是来自癌细胞还是来自单细胞分辨率的正常上皮细胞。例如，1号患者体内的大多数癌细胞在6719_G、12948_T 和 7397_G 上具有肿瘤特异性线粒体突变（图 4A）。患者#1的所有正常组织衍生的类器官在这三个部位都是野生型的（图 4A）。对于肿瘤衍生的类器官，来自Mix的一些细胞和来自Org-1的所有细胞没有肿瘤特异性突变，而来自 Org-2、Org-3 的大多数细胞具有肿瘤特异性突变（图 4B）。这种现象可以用体内肿瘤组织中同时存在癌细胞和正常上皮细胞来解释，并且它们都在体外生长形成类器官。癌细胞在化学成分确定的培养基中的增殖速度比正常上皮细胞的增殖速度慢得多（图3D）。因此，接下来比较了在不同培养基中培养的类器官中癌细胞的比例。作者发现长期培养的肿瘤来源的类器官会丢失具有肿瘤特异性突变的细胞，这表明正常上皮细胞生长更快，在体外培养期间，癌细胞逐渐被正常上皮细胞稀释（图 4A，H）。在条件培养基中长期培养的类器官细胞保持肿瘤特异性突变，这表明癌细胞作为条件培养基中培养的类器官的主要群体得到了保持（图 4D，H）。条件培养基更适合正常上皮细胞和癌细胞上皮细胞的长期培养。研究表明正常组织衍生的类器官表现出一些肿瘤样特征，因此探索了所有患者上皮细胞中VIM和EPCAM的表达模式（图4E）。发现在体内只有一小部分正常上皮细胞共表达VIM和EPCAM。然而，体内的肿瘤上皮细胞以及来自正常组织和肿瘤组织的类器官都具有较高比例的共表达VIM和EPCAM的上皮细胞，通过免疫荧光染色在蛋白质水平上进一步证实了这一点（图4G）。这些证据表明体外培养可能有利于类器官中肿瘤细胞的部分上皮间质转化（EMT）特征。为了排除类器官培养过程中潜在的间充质细胞污染，进一步比较了这些 VIM+ 皮细胞和间充质细胞之间的VIM表达水平。结果表明，VIM+上皮细胞中VIM的表达水平仅为间充质细胞的一半（图4F）。因此，推测体外培养可能会促进类器官中的EMT。
培养的类器官保留了体内相应组织的基因组和全局DNA甲基化特征
接下来，检查了类器官中的突变和CNV，发现正常组织衍生的类器官不包含CNV或肿瘤特异性点突变。除了研究CNV和突变外，作者还研究了在条件培养基中培养的体内组织和类器官的整体DNA甲基化水平，发现类器官可以维持体内相应组织的全局DNA甲基化水平。
类器官培养基的交换
为了进一步验证细胞增殖和干/祖细胞特征维持的差异是由不同的培养基引起的，在后续实验中更换了类器官的培养基，并对这些细胞并列进行了高精度的单细胞RNA-Seq（图5）。结果表明，类器官细胞在换用另一种培养基后，在原培养基中保持了OLFM4和CA2的表达模式（图5A-B）。正常组织衍生的类器官和肿瘤组织衍生的类器官都高度表达体内肿瘤特异性标记基因CEACAM6（图 5C 和 E）。此外，交换培养基不影响上皮细胞的基因组特征（图5D、F）。
总结
作者在两种不同培养基中培养的体内组织和相应类器官进行单细胞RNA测序，结合基因组和DNA甲基化组测序数据，系统地评估了类器官培养系统在分析结直肠癌肿瘤发生的分子特征方面的可靠性。生物信息大数据分析助力实验的工作正在如火如荼的开展，感兴趣的小伙伴千万不要错过了呦！