细胞凋亡作为程序性死亡的核心形式，在发育调控、疾病机制(如癌症、免疫缺陷)及药物研发中具有重要研究价值。针对其复杂动态过程，现有检测方法大致可分为基于细胞形态、生物学功能和生化标记三大类。
本文将系统梳理常用方法的实验原理与实验步骤，并结合典型产品推荐，为研究者提供参考。
01
基于细胞形态
1.1 电镜分析
透射电子显微镜 (TEM) 被认为是检测细胞凋亡的金标准。
细胞凋亡的主要特征是：(1) 电子致密核 (早期边缘化)；(2) 核碎裂；(3) 完整的细胞膜；(4) 杂乱无章的细胞质、 细胞器；(5) 大而透明的空泡；(6) 细胞表面有气泡。
如 Figure 4 所示，TEM 显示 BBR (小檗碱) 或 DDP (顺铂) 诱导大量 OVCAR3 细胞凋亡。变化主要包括细胞 质皱缩、质膜起泡、染色质浓缩和凋亡小体形成。透射电镜的主要缺点是成本高，一次只能检测一小块区域，难以及早发现凋亡细胞[1][5]。
Figure 4. TEM 检测小檗碱 (BBR) (100 μΜ) 和顺铂 (DDP) (5 μg/mL) 诱导 OVCAR3 细胞 24 h 后的细胞凋亡形态[5]。
1.2 细胞核染色分析
在凋亡细胞中，质膜通透性和染色质浓缩发生变化，可以使用 DAPI、Hoechst 以及碘化丙啶 (PI) 荧光染料， 通过流式细胞仪或荧光显微镜轻松检测到。
Figure 5. DAPI, Hoechst 和 PI 的荧光染色效果图[6][7]。
(A) 甲基乙二醛(MG)(1.5 mM, 24 h)诱导PC12细胞凋亡，并用PI和Hoechst 33342染色。
(B) DAPI(蓝色)和TUNEL(绿色)染色凋亡的MODE-K细胞。
02
基于生物学功能
2.1 Annexin V/PI 双染法
Annexin V 属于 Ca2+-依赖性磷脂结合蛋白，可特异性粘附细胞膜上的磷脂酰丝氨酸 (PS)。在健康细胞中， PS 位于质膜的胞质侧，但在凋亡早期转移至细胞膜外。因此，荧光标记 (如 FITC、EGFP 标记) 的 Annexin V 可用于检测细胞凋亡早期细胞膜胞外侧 PS 的存在。PI 一般可与 Annexin V 结合以区分凋亡和坏死细胞，可通过流式细胞仪或荧光显微镜检测[8]。
Figure 6. DAPI, Annexin V-FITC 和 PI 共染的代表性图像，显示 Bufalin (100 nM, 48 h) 诱导 HepG2 细胞凋亡[9]。(A) 共聚焦图像, (B) 流式细胞术分析。
Annexin V/PI 双染法参考[9]：
1. 对于悬浮细胞: 1000 ×g 离心 5 分钟，弃上清。加入 1 mL 预冷的 PBS 轻轻重悬, 1000 ×g 离心 5 分钟， 弃上清。 对于贴壁细胞: 用 PBS 清洗细胞并加入胰蛋白酶 (不含 EDTA) 以分离细胞。添加新鲜培养基并轻轻悬浮细胞 制成单细胞悬浮液。1000 ×g 离心 5 分钟，然后弃去上清液。加入 1 mL 预冷的 PBS 重悬细胞沉淀，1000 ×g 离心 5 分钟弃上清，保留细胞沉淀。
2. 将细胞重新悬浮于 195 μL Binding Buffer 中。 加入 5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI (Propidium Iodide)，室温避光 孵育 10-20 min。孵育过程中可轻轻颠倒数次 ，以加强染色效果。
3. 检测与分析
(1) 流式细胞仪检测: Annexin V-FITC (Ex=488 nm; Em=525 nm) 绿色荧光，在 FL1 通道检测；
PI-DNA (Ex=535 nm; Em=617 nm) 红色荧光，在 FL2 或 FL3 通道检测。活细胞呈现为 Annexin V− /PI−阴性， 早期凋亡细胞为 Annexin V+ /PI− ，而晚期凋亡细胞为 Annexin V+ /PI+ 。
(2) 荧光显微镜检测: 1000 ×g 离心 5 分钟，弃去上清，加入 50-100 μL Binding Buffer 轻轻重悬细胞沉淀，涂片后用荧光显微镜检测荧光强度。
2.2 线粒体膜电位检测
细胞凋亡被认为与线粒体通透性孔的开放和电化学梯度的丧失有关，线粒体跨膜电位 (∆ΨM) 的下降是细胞凋亡 的标志，可用于早期细胞凋亡检测。 JC-1 染料是一种亲脂性阳离子染料，广泛用于检测多种细胞类型的 ∆ΨM 变化。其原理为: 在具有较高 ∆ΨM 的健康细胞中，JC-1 染料可进入细胞并在线粒体中积累，形成 J-aggregates (Ex/Em=585/590 nm, 橙红色荧光)。在凋亡细胞中，∆ΨM 较低，JC-1 染料进入线粒体较少，以单体形式存在 (Ex/Em=510/527 nm, 绿色荧光)。
因此，通过荧光显微镜或流式细胞术检测 JC-1 的红/绿荧光比值可用于评估细胞凋亡状态[10]。
JC-1 染色参考[11]：
悬浮细胞
1. 以 6 孔板为例，每孔用 1 mL 培养基重悬 100 万细胞，并根据实验处理细胞。
2. 细胞染色
(1) 阳性对照：取适量CCCP (50 mM)恢复至室温，在阳性对照孔中加入1 μL (终浓度为50 μM)，37℃孵育5 分钟 。
(2) 实验组：取适量 JC-1 (200 μM) 恢复至室温，每孔加入 10 μL (终浓度为 2 μM)。37°C，避光孵育 15-20 分钟。
3. 孵育结束后，400 ×g 4℃ 离心 3-4 分钟，沉淀细胞，弃上清。
4. 用 PBS (1×) 洗涤 2 次：加入 2 mL PBS (1×) 重悬细胞，400 ×g 4℃ 离心 3-4 分钟，沉淀细胞，弃上清。
5. 用 500 μL 的 PBS (1×) 重悬细胞。
6. 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计或流式细胞仪分析 (JC-1 单体呈现绿色荧光： Ex/Em=510/527 nm；JC-1 聚集体呈现红色荧光：Ex/Em=585/590 nm)。
贴壁细胞
1. 若用荧光分光光度计或流式细胞仪检测贴壁细胞，可先对贴壁细胞进行消化、收集，重悬后参考悬浮细胞的 检测方法。
2. 若用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测，JC-1 染色完成后弃上清，用 PBS (1x) 洗涤 2 次，加入 500 μL PBS (1x)，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察即可。
Figure 7. Ang/TAT-sgGSS-EVs 处理胶质母细胞瘤细胞48h 后，通过 JC-1 (HY-15534) 检测线粒体膜电位变化 (显著下降)[12]。
结果显示，经 Ang/TAT-sgGSS-EVs 处理后，线粒体膜电位 MMP (∆φM) 显著降低，具体表现为绿/红荧光比值 增加。表明 Ang/TAT-sgGSS-EVs 有效地破坏了靶基因并加剧了放射治疗 (RT) 引起的铁死亡。
03
基于生物学功能
如前所述，细胞凋亡途径最终均导致 Caspase-3 的切割和激活。因此，可以通过 Caspase-3 来对晚期细胞 凋亡进行检测。此外，细胞凋亡的其他生物标志物还包括活化的 Caspases 2/7/8/9, Cytochrome c, Bcl-2/Bcl-xl/Mcl-1, PARP 等。这些生物标志物可以通过多种方式检测，包括免疫印迹、免疫沉淀和免疫组化[13]。
Figure 8. Infliximab (10 μg/mL, 24/48 h) 而非Etanercept (10 μg/mL, 24/48 h)
激活淋巴细胞中的 Caspase 3 (通过Western blot检测)[14]。
3.2 DNA 片段检测
3.2.1 DNA 阶梯技术
在凋亡细胞中，DNA 被核酸内切酶切割，细胞凋亡的后期会发生 DNA 片段化。从而导致了一个特征性的“DNA 阶梯”(在琼脂糖凝胶上显现)，阶梯中的每个条带大小相隔大约 180 个碱基对。因此，可通过 DNA 阶梯技术来 进行检测[1]。
Figure 9. 暴露于 DNA 损伤条件 (UV, Etoposide 30 μM, γ 100 Gy) 下， Jurkat 细胞中的 DNA 片段化[15]。
3.2.2 TUNEL 染色法
TUNEL 染色法的原理是：片段化的 DNA 末端产生游离的 3’-OH 基团。荧光探针标记的 Dutp 可通过末端 脱氧核苷酸转移酶 (TdT) 添加到暴露的 3'-OH 基团上，从而使 DNA 片段产生荧光，可通过荧光显微镜或者 流式细胞仪来检测[16]。
TUNEL 染色法参考 (HY-K1079 为例)：
(1) 洗涤：离心收集细胞 (不超过 2×106 个细胞)，加入 PBS 洗涤 2 次，每次 5 分钟。
(2) 固定：加入固定液 4℃ 固定 30 分钟。建议置于摇床上固定，以防止细胞聚团。
(3) 洗涤：加入 PBS 洗涤 2 次，每次 5 分钟。轻轻弃去 PBS，并用滤纸吸去多余的液体。
(4) 通透：加入通透液室温孵育 5 分钟。
(5) 洗涤：加入 PBS 洗涤 2 次，每次 5 分钟。轻轻弃去 PBS，并用滤纸吸去多余的液体。
注：贴壁细胞/石蜡切片/冰冻切片样品处理方法见 MCE 产品说明书。
2. 标记与检测
(1) 加入 50 μL TUNEL 工作液，37℃ 避光孵育 1 小时。
(2) 加入 PBS 洗涤 3 次。加入 250-500 μL PBS 充分悬浮细胞。
(3) 用流式细胞仪检测或涂片后在荧光显微镜下观察。Cy3 (Ex=550 nm; Em=570 nm) 染色后，凋亡细胞显示 红色荧光 (用 HY-K1078 则凋亡细胞呈绿色荧光)，正常细胞无荧光。
注：若 TUNEL 反应过强，可用 TdT Dilution Buffer 将 TdT Enzyme 稀释 2-5 倍后再进行操作。
Figure 10. 高渗 500 mOsm 培养基中角膜上皮细胞死亡增加，SP600125 (20 μM, 24 h) 显著减少细胞死亡 (通过 TUNEL 染色确定) [17]。
无论是基础研究或药物开发，精准检测细胞凋亡是关键。形态学方法验证结构变化，功能学工具（如膜电位检测）揭示机制，生化标记（如TUNEL）量化结果。MCE多款明星产品（如Annexin V-FITC试剂盒、Caspase-3抗体）适配不同场景，助您高效获取高质量数据。
04
参考文献
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