心情驿站27 条热帖，今日新增 5 条
行业动态23 条热帖，今日新增 2 条
修复重建和烧伤整形22 条热帖，今日新增 3 条
皮肤性病13 条热帖，今日新增 3 条
危重急救9 条热帖，今日新增 1 条
普通外科8 条热帖，今日新增 2 条
骨科6 条热帖，今日新增 1 条
求职职场6 条热帖，今日新增 1 条
消化内科5 条热帖，今日新增 1 条
妇产5 条热帖已更新
临床内科
心血管2 条热帖已更新
呼吸胸外2 条热帖已更新
神经内外最近热帖已更新
肿瘤医学3 条热帖已更新
内分泌2 条热帖已更新
肾脏内科最近热帖已更新
精神心理最近热帖已更新
风湿免疫最近热帖已更新
血液病最近热帖已更新
消化内科5 条热帖，今日新增 1 条
感染最近热帖已更新
临床外科
心血管2 条热帖已更新
呼吸胸外2 条热帖已更新
神经内外最近热帖已更新
肿瘤医学3 条热帖已更新
泌尿外科4 条热帖已更新
普通外科8 条热帖，今日新增 2 条
修复重建和烧伤整形22 条热帖，今日新增 3 条
耳鼻咽喉头颈外科最近热帖已更新
骨科6 条热帖，今日新增 1 条
临床妇儿
妇产5 条热帖已更新
儿科1 条热帖已更新
临床其他
危重急救9 条热帖，今日新增 1 条
影像核医学1 条热帖已更新
中医最近热帖已更新
皮肤性病13 条热帖，今日新增 3 条
临床检验1 条热帖已更新
超声医学1 条热帖，今日新增 1 条
麻醉疼痛最近热帖已更新
康复医学最近热帖已更新
护理最近热帖已更新
社区全科最近热帖已更新
临床病理最近热帖已更新
口腔最近热帖已更新
眼科最近热帖已更新
公共卫生最近热帖已更新
考试深造
论文写作最近热帖已更新论文写作投稿统计与作图医学英语基金申报开题
本科考研最近热帖已更新考研本科教育
考博留学最近热帖已更新考博留学考试
执业考试最近热帖已更新
规培1 条热帖已更新
职称晋升最近热帖已更新
行业讨论
行业动态23 条热帖，今日新增 2 条
求职职场6 条热帖，今日新增 1 条
心情驿站27 条热帖，今日新增 5 条
科研医药
基础科研细胞生物与生物信息微生物与免疫实验动物与生化组胚细胞技术与形态遗传核酸基因技术蛋白质和糖学实验室建设与采购
医药研发与应用最近热帖已更新合理用药新药信息药理及临床试验药物化学分析技术制剂技术生物制药
其他
学习交流互助专区
更多内容
细胞死亡方式的另一种方式被称为细胞坏死，但是细胞凋亡和细胞坏死具有截然不同的特征，细胞凋亡是一种主动的生理反应，细胞坏死则是细胞对严重损伤的一种被动反应和变性过程。凋亡过程受细胞内一系列相关的分子所调控，涉及一系列复杂的生理生化反应，并伴随有典型的形态学改变，最终导致细胞的解体。凋亡细胞的许多形态学改变是特征性的，甚至是唯一与凋亡相关的，因此可以作为检测凋亡的基础。凋亡检测的关键是将凋亡细胞与正常细胞以及坏死细胞进行准确的区分。
No.1
凋亡的程序性死亡特点
No.2
细胞凋亡的过程及标志
一、细胞凋亡过程
细胞凋亡过程及形态的改变根据细胞凋亡过程中的形态学特征变化，将细胞凋亡分为3个过程：
01凋亡起始阶段：
细胞表面特化结构消失;内质网囊腔肿胀变大，线粒体膨大;细胞骨架结构紊乱;染色质凝缩分布在核膜一侧或周围;胞质出现大小不均的空泡。
02 凋亡小体形成阶段：
染色质进一步凝缩并断裂为大小不均一的片段，DNA发生断裂，细胞核解体，细胞质膜或内质网膜包裹着断裂的DNA和破碎的细胞器通形成许多球形小泡，这些有膜包围的小泡被称为凋亡小体。
03吞噬清除阶段：
凋亡小体形成后，被巨噬细胞和邻近的细胞识别并吞噬消化。
二、细胞凋亡的生物化学变化
细胞凋亡时不仅发生明显的形态变化，同时也伴随着许多生物化学变化的发生。比较明显的生物化学变化有以下几种：
No.3
细胞凋亡通过信号传导通路发生，有序而不失节奏的经历着启动、进行、结束的过程。每条传导通路由于受到重要因子的精准调控，天生兼具复杂而独特的机制与气质。
介导凋亡的信号通路主要可分为3大类，分别是线粒体通路、死亡受体通路以及内质网通路。各通路间相互作用、互相联系，共同调节凋亡过程，每条通路中包含不同的实现途径。
一、线粒体通路
线粒体通路
01 Cyt C途径
线粒体是细胞凋亡的调控中心，Cyt C作为关键性分子，是胞核基因编码的蛋白质，其释放介导的凋亡途径与Bcl-2家族成员的调节控制有关。
受到凋亡刺激后（如：DNA的损伤、生长因子缺乏等），引起Bax/Bak形成低聚物复合体，插入到线粒体外膜孔隙，导致线粒体渗透压改变，跨膜电位丢失，促使Cyt C从线粒体释放到细胞质，并与细胞凋亡激活因子1（Apaf-1）结合形成凋亡复合体，活化Caspase-9前体，进而激活Caspase-3和Caspase-7，引发Caspase级联反应，从而诱发细胞凋亡。期间，Smac、Omi和ARTS等其他促凋亡蛋白抑制IAPs，共同促进凋亡反应。
02 PTP通道
蛋白质酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）镶嵌在线粒体内膜和外膜之间，介导形成线粒体通透性转换孔（Mitochondrial Permeability Transition Pore，MPTP），可以无选择性地允许≤1.5 kD分子通过，当线粒体基质内处于高渗透压时，通道开放引起凋亡。
二、死亡受体通路
死亡受体通路
死亡受体（DR）包括多种分子，均属肿瘤坏死因子受体TNFR基因超家族。目前已知的死亡受体有5种，TNFR-1、Fas（CD95）、DR3、TRAIL-R1（DR4）和TRAIL-R2（DR5）。
01Fas/FasL和TRAILR/TRAIL途径
作为肿瘤坏死因子TNF家族促凋亡成员，FasL和TRAIL分别与死亡受体Fas（CD95）、TRAIL-R1（DR4）或TRAIL-R2（DR5）结合，形成死亡诱导信号复合体（DISC），DISC包含接头分子FADD和Caspase-8酶原，Caspase-8酶原自我剪切形成活性Caspase-8，启动下游的Caspase级联反应。
其次，活化的Caspase-8能够切割Bcl-2家族促凋亡蛋白Bid，产生的带羧基片段tBid可以转移到线粒体，与线粒体膜结合引起线粒体释放Cyt C等促凋亡物质，引发凋亡反应。
02TNFR1/TNF途径
在TNFR-1介导的凋亡通路中，三聚化的TNFR-1募集接头蛋白TRADD，TRADD通过自身的DD可汇聚FADD、RIP和TRAF-2。这里分2条通路：
因此，TNFR可能参与凋亡和抗凋亡两种截然相反的信号途径。TNFR通路活化后，细胞的发展方向取决于双方的信号水平强弱等因素。
三、内质网通路
内质网通路
内质网在细胞中负责蛋白的合成、加工和修饰。在病毒感染、钙稳态失调等的情况下，致使非折叠蛋白的累积和聚集，导致严重的内质网应激反应（ER stress）。越来越多的研究显示，持续的ER stress大多来源于非折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）状态的改变。
01 IRE1信号通路
UPR条件下，IRE1-JNK帮助细胞自救，是重要的信号通路。一方面，IRE1活性运动可切割XBP-1 mRNA，使它成为有效的转录激活因子，诱导蛋白基因转录，编码ER分子伴侣，缓解ER压力。另一方面，IRE1可结合TRAF2，通过激酶活性增加ER stress，在ASK1存在条件下，激活JNK。持续的ER stress使得IRE1募集TRAF2，激活ASK和JNK的蛋白激酶，启动凋亡级联。
02PERK信号通路
ER stress增加PERK蛋白激酶活性，PERK磷酸化elF2，抑制蛋白翻译和合成，缓解ER压力。同时，elF2的磷酸化能够选择性地启动ATF4翻译，增加其结合配体的合成，影响氨基酸代谢，从而抑制蛋白的翻译和合成。
正常情况下，CHOP在细胞质中维持低水平表达。当ER stress发生时，Bip/GRp78与内质网跨膜蛋白PERK、ATF6等的解离均能激活CHOP。
CHOP诱导凋亡蛋白（如：GADD34、ERO1、DR5）的表达，可直接激活GADD34，促进ER下游蛋白的生物合成。实验显示，氧化酶ERO1a很可能在二硫键形成过程中介导适应性反应失败或持续性压力。因此，CHOP的过度表达能够导致活性氧（ROS）的产生，引发ER stress，介导凋亡。同时，CHOP的大量表达，也可引起Bcl-2表达的下降，导致Bax从细胞质转运至线粒体，启动线粒体凋亡通路。
四、Ca2+途径
Ca2+途径
在体内，Ca2+浓度对维持线粒体膜的通透性起着重要作用，线粒体内钙离子浓度的上升会导致ROS的产生，进而释放Cyt C，诱导凋亡。
Ca2+也可维持内质网的稳定，并且调控了大量的酶反应。其正常状态的改变可引发ER stress，开启JNK通路，刺激Bax活化。除此之外，Ca2+能够调节Calpain，Calpain切割Bax N端，产生促凋亡片段，可促进凋亡反应。
No.4
细胞凋亡检测方法
在生物学研究过程中常常需要检测细胞凋亡情况。目前至少有十数种检测细胞凋亡的方法，大致可分为基于细胞形态、生物学功能和生化标记三大类。每一方法都有其优缺点，需要根据实际情况选择最为适合的方法。
一、基于细胞形态的方法
基于细胞形态的方法
01 电子显微镜检测方法：
电镜检查是鉴定凋亡的金标准。
在透射电镜下，凋亡细胞体积变小。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei），染色质高度盘绕，出现许多空泡结构；Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；凋亡晚期出现核解体，产生凋亡小体。
缺点：
无法定量（电镜一个视野仅能观察一两个细胞）
实验步骤繁琐（固定、切片到拍照）
并非所有实验室都能接触到电镜。
02 细胞核形态染色法
相比细胞凋亡的其他形态变化，利用荧光染料配合荧光显微镜对细胞核形态的观察也是较为直接的指标。常用的 DNA 特异性染料有：Hoechst、DAPI以及碘化丙啶(PI)。Hoechst 是与 DNA 特异结合的活性染料；DAPI 为半通透性，用于常规固定细胞的染色；PI不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来（Annexin-V/PI法）。
二、基于生物学功能的方法
基于生物学功能的方法
01 Annexin-V/PI双染色法
磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）位于正常细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin V是一种Ca2+依赖磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和力。将荧光标记（FITC、PE或 biotin）的Annexin V作为探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。AnnexinV联合PI法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法
缺点：
制备贴壁细胞样品时，很容易因消化和吹打造成细胞额外损伤，从而夸大了实验结果，增加了数据变异度。
凋亡细胞的本底荧光或非特异染色的特性会增强，导致荧光飘移，导致定量不准。
02线粒体膜电位检测
线粒体跨膜电位的下降也是凋亡细胞一个重要特点，是细胞凋亡过程中最早发生的事件（早于核形态的变化和PS的外翻）。一旦线粒体跨膜电位崩溃，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。一些亲脂性阳离子荧光染料如 Rhodamine 123、DiOC6、JC-1、TMRM等，在线粒体跨膜电位存在的情况下可结合到线粒体基质，通过荧光显微镜观察其荧光的增强或减弱可反应线粒体内膜电负性的增高或降低。
三、基于生化标记方法Caspase-3活性检测
基于生化标记方法Caspase-3活性检测
Caspase(cysteinyl-aspartic acid proteases)蛋白家族的活化是细胞凋亡的典型特征，在介导细胞凋亡过程中具有非常重要的作用。其中Caspase-3作为关键的执行分子在细胞凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常细胞中以酶原形式存在，在凋亡早期被的活化，但在凋亡晚期及死亡细胞中，Caspase-3活性显著下降。因此在试验过程中可以通过检测检测Caspase剪切体的含量或Caspase的活性来反应细胞凋亡过程。
01
DNA损伤检测
在细胞凋亡的后期，Caspase会激活Caspase-ActivatedDNase（CAD），切割核小体之间的DNA，形成以180-200bp为单位的DNA片段，经琼脂糖电泳后形成DNAladder。
缺点：耗时，无法定量，以及结果不稳定
02
DNA片段原位标记
细胞死亡（凋亡或坏死）时，DNA发生断裂。此时大量的粘性 3'-OH 末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到 DNA 的 3'- 末端，从而可进行凋亡细胞的检测。